基于分子印迹光学传感器的心肌肌球蛋白结合蛋白C(cMyBP-C)检测方法的制备研究

《ACS Omega》：Preparation of Optical-Based Sensors for the Determination of Cardiac Myosin-Binding Protein C

　　

本研究采用微接触印迹(microcontact imprinting)法，制备了以cMyBP-C(心肌肌球蛋白结合蛋白C，cardiac myosin-binding protein C)为模板分子、以聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯-N-甲基丙烯酰氧基-(L)-色氨酸)(poly(2-hydroxyethyl methacrylate-N-methacryloxy-(L)-tryptophan)，poly(HEMA-MATrp))为聚合膜的心肌肌球蛋白结合蛋白C印迹(MIP)与非印迹(NIP)表面等离子体共振(SPR，Surface Plasmon Resonance)传感器，用于cMyBP-C的检测。研究人员通过接触角测量与原子力显微镜(AFM，Atomic Force Microscopy)对cMyBP-C印迹(MIP)及非印迹(NIP) SPR传感器进行了表面表征。动力学分析在0.05–300 ng/mL浓度范围内进行，检出限(LOD，Limit of Detection)与定量限(LOQ，Limit of Quantification)分别为0.019 ng/mL和0.064 ng/mL。所有动力学分析中的平衡、吸附及解吸循环均在10 min内完成。研究人员以模板分子cMyBP-C的竞争分子肌酸激酶MB同工酶(CK-MB，creatine kinase-MB)和心肌肌钙蛋白T(cTnT，cardiac troponin T)考察了MIP SPR与NIP SPR传感器的选择性，MIP SPR传感器对cMyBP-C/cTnT和cMyBP-C/CK-MB的相对选择性系数分别为3.85倍和12.64倍。研究人员分别在SPR系统与酶联免疫吸附测定(ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)中，使用人工血浆样品加标溶液验证了MIP SPR传感器的适用性。

论文解读：基于分子印迹聚(HEMA-MATrp)膜的cMyBP-C表面等离子体共振(SPR)传感器的制备及性能研究

本研究发表于ACS Omega。心肌肌球蛋白结合蛋白C(cardiac myosin-binding protein C, cMyBP-C)是心肌肌小节粗丝区关键的结构与调节蛋白，其磷酸化异常、基因突变或蛋白酶解降解与心肌梗死、肥厚型及扩张型心肌病密切相关，被视为有潜力的新型心脏生物标志物。目前临床常用酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫比浊法和Western blot检测cMyBP-C，但这些方法存在样品前处理繁琐、耗时长、需专业人员操作等局限。表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技术具备实时、无标记、高灵敏度及适于动力学分析的优势，分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology, MIT)则可制备对目标分子具特异性识别位点的合成聚合物——分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer, MIP)。将二者结合有望克服传统免疫传感器的抗体不稳定、成本高及选择性不足问题。因此，研究人员采用微接触印迹法在金膜SPR芯片表面制备cMyBP-C印迹poly(HEMA-MATrp)聚合物传感界面，系统评估其表征、检测性能、选择性、人工血浆适用性及可重复使用性。

主要关键技术方法：

研究人员以cMyBP-C为模板分子，采用微接触印迹(microcontact imprinting)法，先在玻片表面经3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰及戊二醛交联固定cMyBP-C制备"蛋白印章"，同时在金包覆SPR芯片表面经烯丙基硫醇(allyl mercaptan)自组装单分子层修饰后，滴加含N-甲基丙烯酰-L-色氨酸(MATrp)单体、2-羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)交联剂及偶氮二异丁腈(AIBN)引发剂的预聚物溶液，与蛋白印章贴合后经365 nm紫外光聚合，移除印章洗脱模板即得MIP SPR传感器；同步制备不加模板的NIP SPR传感器作对照。以裸金芯片、MIP及NIP传感器为对象，用接触角、原子力显微镜(AFM)及傅里叶变换衰减全反射红外光谱(FTIR-ATR)表征表面性质；在SPRimager II系统上用pH 7.4磷酸盐缓冲液及人工血浆中不同浓度cMyBP-C进行结合—解吸动力学测定，以10%乙二醇为解吸液；以cTnT和CK-MB为竞争物评价选择性并计算相对选择性系数(k')；在人工血浆加标样本中验证回收率并与ELISA比对；对同一芯片连续进行吸附—解吸循环及第1、2、4、6个月存储后测试以评价复用性与储存稳定性。

3.1. 表面表征(Surface Characterization)

研究人员测得裸金、MIP SPR及NIP SPR传感器表面接触角分别为79.1°、83.3°和82.4°，MIP与NIP因含疏水模板分子及MATrp单体使接触角增大，表明表面修饰成功；MIP SPR传感器因印迹空穴形成表面粗糙度(R_a)达113.94 nm，高于NIP(90.34 nm)及裸金(8.23 nm)，AFM结果显示印迹成功。FTIR-ATR谱图中MIP SPR传感器聚合物膜在约1657 cm^–1(酰胺I带C=O伸缩)和1532 cm^–1(酰胺II带N–H弯曲与C–N伸缩)出现蛋白质特征吸收峰，NIP膜无此峰，证实cMyBP-C被成功印迹入poly(HEMA-MATrp)膜并产生特异性分子相互作用。

3.2. cMyBP-C结合的动力学分析(Kinetic Analysis of cMyBP-C Binding)

研究人员在0.05–300 ng/mL浓度范围进行SPR动力学检测，MIP SPR传感器在0.05–50 ng/mL范围内响应(y = 0.0776x + 0.3017, R²=0.9088)呈良好线性，高浓度区(100–300 ng/mL)趋于饱和。依3S/m计算得检出限(LOD)为0.019 ng/mL，定量限(LOQ)为0.064 ng/mL。Langmuir吸附等温线模型拟合最佳，理论最大响应值ΔR_max(8.203)与实验值(8.29)接近，表明cMyBP-C与MIP SPR传感器间为均质单层结合且侧向作用极小，结合动力学分析显示cMyBP-C与MIP SPR传感器表面的结合吻合度达99%。

3.3. 选择性研究(Selectivity Studies)

研究人员以100 ng/mL cTnT、CK-MB及二者混合液、cMyBP-C+cTnT+CK-MB三元混合液上样。MIP SPR传感器对cMyBP-C响应(ΔR=7.08)显著高于对cTnT(ΔR=1.84)和CK-MB(ΔR=0.56)；相对选择性系数k'对cMyBP-C/cTnT为3.85，对cMyBP-C/CK-MB为12.64，印迹因子(IF=ΔR_MIP/ΔR_NIP)为10.56，证明印迹产生特异性识别空穴，可有效区分结构与尺寸相近的心脏生物标志物。三元混合物中因竞争结合致cMyBP-C信号略降至5.97，但仍明显高于单一竞争物信号，表明传感器具良好选择性。

3.4. 人工血浆中的分析(Analysis in Artificial Plasma)

研究人员在人工血浆基质中对加标50 ng/mL和100 ng/mL cMyBP-C进行SPR检测，回收率分别为99.42%和97.93%，与同期ELISA检测结果(98.29%、97.94%)吻合良好，说明MIP SPR传感器在复杂生物基质中抗干扰能力强，具备临床潜在应用价值。

3.5. 可重复使用性研究(Reusability Studies)

同一MIP SPR芯片当日连续4次吸附—解吸循环后结合容量保持初始的96.46%；第6个月存储后测试保留约91%初始结合能力，表明该MIP SPR传感器具较好日内复用性与中期储存稳定性。

结论(Conclusions)总结：

研究人员通过微接触印迹法在SPR金芯片表面成功制备cMyBP-C印迹poly(HEMA-MATrp)薄膜传感器。MIP SPR传感器对cMyBP-C的LOD为0.019 ng/mL，LOQ为0.064 ng/mL；印迹因子为10.56；Langmuir吸附等温模型表明cMyBP-C与传感器界面为均质单层结合；相对选择性系数对cTnT和CK-MB分别达3.85和12.64倍；人工血浆加标回收率为97–99%；同芯片可重复使用该日4次仍保持>96%响应，6个月后仍保有约91%初始性能。结果表明，该cMyBP-C分子印迹SPR传感器可实现选择性好、响应快、低检出限的cMyBP-C检测，在心脏生物标志物的临床检测研究中具有良好的应用前景。