通过光谱学与电生理学特征的互相关增强神经毒性检测的灵敏度

《ACS Omega》：Enhanced Sensitivity in Neurotoxicity Detection via Cross-Correlation of Spectroscopical and Electrophysiological Features

　　

利用电生理学读数进行神经毒性检测在感知化学诱导的神经元离子通道变化方面存在局限。因此，对神经元生化环境的辅助性了解可能揭示隐藏的神经毒性机制。本研究整合了通过拉曼光谱（Raman spectroscopy）的光谱学读数和通过微电极阵列（microelectrode array, MEA）的电生理学读数，以监测已知癫痫样诱导剂加巴嗪（gabazine）对大鼠原代神经元细胞的神经毒性效应。在加巴嗪暴露前后，对光谱学和电生理学特征进行的监测与相关性分析，突显了监测和关联这些生物学互补特征的优势，为药物发现与开发（drug discovery and development）流程中的神经毒性检测提出了一种创新且更灵敏的方法。

药物发现与开发流程漫长且昂贵，平均耗时15年，成本约20亿美元。其中，安全性相关的损耗是关键瓶颈，神经毒性是导致约四分之一新药候选化合物中止的主要原因，且常在临床试验等后期阶段显现，造成经济负担并威胁人类志愿者健康。市场上已有部分药物因对神经系统产生不良副作用（如自杀倾向、镇静、滥用倾向、癫痫/惊厥等）而受到严格处方和监测，甚至因治疗窗窄而撤市。这迫切需要在药物开发早期阶段设计具有更高灵敏度的新工具来评估神经毒性，以揭示在药物警戒（pharmaceutical surveillance）期间导致药物撤市的“隐藏”神经毒性机制。

功能性神经毒性筛选通常采用电生理学技术，如膜片钳（patch clamp）、电压敏感染料（voltage-sensitive dyes）和微电极阵列（microelectrode array, MEA）。其中，MEA技术能通过放电频率（firing rate）、爆发频率（burst frequency）、爆发间期（interburst interval）、平均爆发持续时间（mean burst duration）等生物特征，对神经元细胞的电生理活动进行非破坏性、纵向记录。然而，MEA技术在识别不作用于离子通道受体的神经毒性机制（如形态学和生化变化）方面存在不足，且电极上的净电生理活动可能因相位和形态上相互抵消的同步峰电位（spike）而为零，影响长期电生理分析。因此，神经毒性检测的改进需提供：1）集成、多重、非破坏性读数；2）利用峰电位排序分析（spike-sorting analysis）进行实时神经元识别；3）替代方法。

基于此，研究人员在先前工作的基础上，开发了一种在化学暴露前后同步提取光谱学和电生理学活性的优化方案。本研究以加巴嗪（一种癫痫样诱导剂）处理大鼠原代神经元细胞，监测化学处理前后生物特征的相关性。研究表明，对细胞色素C（cytochrome C）、脂质（lipids）、蛋白质（proteins）、峰电位频率（spike frequency）、爆发频率（burst frequency）、爆发间期（interburst interval）、爆发内峰电位百分比（percentage of spikes within a burst）和爆发持续时间（burst duration）等生物特征的相关性监测，提供了比独立的MEA和拉曼读数（通过曼-惠特尼检验，Mann–Whitney test）更灵敏的读数，突显了源自集成光谱-电学读数的特征互相关具有更高的灵敏度。该研究发表于《ACS Omega》。

为开展研究，研究人员采用了几个关键技术方法：首先，利用微电极阵列（MEA）平台进行非侵入性、纵向电生理记录，监测神经元网络的峰电位和爆发活动；同时，采用拉曼光谱（Raman spectroscopy）进行非破坏性光学测量，获取单细胞水平的代谢和健康状态信息，重点关注细胞色素C、脂质和蛋白质的拉曼散射特征。实验使用原代大鼠海马神经元（购自Lonza），在定制培养室中于生理条件下（37°C, 5% CO₂）进行培养和同步测量。数据处理方面，电生理数据通过多通道分析器（Multi Channel Analyzer）提取特征；拉曼数据经过截断、宇宙线去除、噪声过滤、基线扣除和平滑等预处理后，在MATLAB中进行归一化和中值计算，并最终进行特征互相关分析（使用Pearson相关）。

**研究结果**

**1. 神经毒性研究方案的开发**
研究人员设计了一种新方案，在加巴嗪（30 μM，10分钟）暴露前后，同步进行拉曼成像和电生理记录。拉曼测量采集五个拉曼图谱，其时间略长于电生理记录，形成了小的仅进行拉曼成像的时间窗口。该方法旨在关联化学暴露前后的光谱学和电生理学特征，通过对每种条件下测量的五个中值进行平均，并将其与加巴嗪暴露前后神经元细胞的相应电生理活动相关联。

**2. 特征互相关作为神经毒性筛选的新方法**
对加巴嗪暴露前后整个数据集的电生理学分析（使用曼-惠特尼检验）未观察到显著性差异。只有神经元放电频率的变化接近显著性（p值0.05528），而其他电生理特征（爆发频率、爆发间期、爆发持续时间、爆发内峰电位百分比）的p值均远未达到统计学显著差异。同样，对细胞色素C、脂质和蛋白质的相对拉曼散射进行的曼-惠特尼检验也未发现加巴嗪暴露后的任何显著变化（p值分别为0.7983、0.7983和0.37109）。这表明单一特征分析未能检测到加巴嗪引起的显著变化。

**3. 集成读数的特征互相关分析**
研究人员对整个光谱-电生理特征进行了广泛的互相关分析。在基线对照测量中，细胞色素C与爆发频率、爆发持续时间以及爆发内峰电位百分比之间存在统计学显著相关性。细胞色素C与放电频率之间的Pearson值接近0.7，表明这些特征之间存在强耦合。脂质与爆发内峰电位百分比之间，以及爆发频率与爆发持续时间、爆发内峰电位百分比和放电率之间也存在显著相关性。

加巴嗪暴露后，生物特征的互相关发生了显著变化。细胞色素C与爆发频率、爆发持续时间之间的Pearson互相关性丧失；而在细胞色素C、脂质和蛋白质之间，以及脂质与蛋白质之间观察到了新的、正向的显著互相关，表明这些分子可能在加巴嗪处理后建立了更紧密的代谢网络以支持增加的电活动（参见放电率）。相反，加巴嗪暴露导致电生理特征（即爆发频率、爆发持续时间、爆发内峰电位百分比和放电率）之间的显著相关性丧失。只有爆发内峰电位百分比与细胞色素C和脂质之间的Pearson互相关在加巴嗪暴露后保持稳定。

**讨论与结论**

基于初步研究结果，研究人员推测细胞色素C与电生理特征之间的关系是早期感知神经元细胞毒性的关键，探索这些关系可能揭示神经退行性疾病背后的生化机制。研究表明，能够同时监测多个变量并进行互相关的集成光谱-电生理读数，在新型药物候选化合物的神经毒性检测中具有更高的灵敏度，并可能有助于更高效的药物发现与开发流程。本研究暗示了开发一种研究和感知神经毒性机制新方法的可能性。具体而言，可以将具有已知作用机制的毒性化合物的互相关矩阵输入深度学习模型，以识别和表征待探索分子（如果存在）产生神经元副作用的方式，从而促进药物发现与开发流程中化学库的大通量筛选。

总之，研究人员提出这种方法作为一种潜在手段，用于更稳健地检测神经毒性，但需要进一步的研究和验证，最好由独立研究小组进行。