基于FRET的评估共价弹头反应活性的方法

《ACS Omega》：A FRET-Based Assay for Assessing Covalent Warhead Reactivity

　　

共价模式在药物发现中变得越来越重要，然而，评估亲电弹头对不同亲核试剂的固有反应活性的可靠方法仍然是一个挑战。尽管基于福斯特共振能量转移（F?rster Resonance Energy Transfer， FRET）的荧光传感器在化学生物学中被广泛用于检测各种分析物，但其在探究共价弹头反应活性方面的潜力尚未被探索。本文中，研究人员报告了一种基于FRET的荧光平台的设计与应用，用于评估共价弹头对生物亲核试剂的反应活性。该系统包含一个基于砜的亲核芳香取代（Nucleophilic Aromatic Substitution， SNAr）弹头，桥连着一个香豆素荧光供体和一个二硝基苯基暗淬灭剂，形成了一个FRET二元体。该二元体作为一个基于反应的荧光传感器运行，其中SNAr反应破坏了FRET并允许荧光读数，从而量化共价弹头的反应活性，并展示了对硫醇的强选择性。该测定以96孔板形式进行，能够实现对亲核试剂和反应条件的高通量筛选。这种多功能方法为评估共价弹头反应活性提供了一个强大的工具，促进了化学生物学和药物发现中的机理研究。

**研究背景与问题**
在过去的十年中，通过共价模式进行蛋白质修饰已成为药物化学和化学生物学领域的关键策略。靶向共价抑制剂（Targeted Covalent Inhibitors， TCIs）通过结合非保守、非催化的氨基酸残基，近年来在药物发现项目中，特别是在肿瘤学和蛋白激酶研究领域，取得了成功。除了激酶，TCIs也已被开发用于针对其他蛋白质类别，如KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒）和SARS-CoV-2。共价性一直是化学生物学，特别是活性基团蛋白质谱（Activity-Based Protein Profiling， ABPP）领域的主要支柱。生物共轭化学通常靶向半胱氨酸、赖氨酸和丝氨酸等氨基酸残基。其中，半胱氨酸由于其丰度低且作为亲核试剂对多种亲电试剂具有高反应活性而备受青睐。在共价模式开发中，已使用多种反应性基团作为弹头。亲核芳香取代（SNAr）弹头代表了一类相对较新且探索较少的用于共价蛋白质靶向的亲电试剂。SNAr弹头具有可调节的反应活性、对半胱氨酸的高选择性、结构刚性、良好的代谢稳定性和简单的合成可及性等优点。与迈克尔加成受体不同，SNAr弹头不与氧化半胱氨酸物种（如次磺酸或S-亚硝基硫醇）反应，从而在生物环境中提供了改进的选择性。评估弹头对目标氨基酸的固有反应活性通常在溶液中进行，测试相应亲电试剂对受保护的氨基酸（如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸等）或小肽（如谷胱甘肽）的反应。这些测定通常在生理pH下进行，尽管已有报道在更高pH值下进行赖氨酸反应性测定以模拟蛋白质微环境中可能发生的pKa扰动。大多数反应性测量通常使用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）或核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance， NMR）光谱进行，而高通量方法则较少见。通过使用比色或荧光试剂（如Ellman试剂）进行硫醇定量，这些方法已广泛用于基于片段的筛选。然而，它们通过硫醇消耗间接测量亲电试剂反应性，从而将范围限制在半胱氨酸亲核试剂。荧光传感和成像为检测生物环境中的特定分析物提供了独特且有价值的方法。用于生成荧光传感器的最常用机制之一是福斯特共振能量转移（FRET）。FRET是一种非辐射过程，其中FRET供体通过长程偶极-偶极相互作用将激发能量转移给FRET受体。尽管针对半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针已被广泛开发，包括开启型荧光、比率型和基于FRET的探针，但这些探针通常是为分析物检测而设计的，而不是用于系统评估亲电试剂反应性。据研究人员所知，利用FRET机制作为通用测定平台，以高通量形式量化共价弹头对不同亲核试剂的反应活性尚未被探索。

**研究目的与意义**
为填补这一空白，研究人员设计了一种开启型荧光传感器，在FRET框架内结合了基于砜的SNAr弹头，以评估亲电试剂对各种氨基酸和谷胱甘肽的反应活性。在这项设计中，弹头作为荧光团（FRET供体）和淬灭剂（FRET受体）之间的分子桥。在与亲核试剂反应后，淬灭剂被裂解，FRET不再起作用，从而允许检测供体的发射。该测定针对96孔板格式进行了优化，能够同时高通量筛选亲核试剂和缓冲条件。这种方法并非作为生物传感器，而是作为一种基于反应的测定法，能够对多种亲核试剂的弹头反应性进行比较评估，这是针对特定分析物优化的传统荧光探针难以实现的。本研究描述了基于FRET的平台的设计、合成和验证，并展示了其在生理相关条件下定量分析共价弹头反应活性的实用性。该研究发表在《ACS Omega》期刊上。

**关键技术方法**
研究人员开发并验证了一个基于FRET的荧光测定平台。关键方法包括：1） 分子设计与合成：设计并合成了FRET二元体，该分子包含一个7-甲氧基香豆素作为荧光供体、一个二硝基苯基衍生物作为暗淬灭剂，两者通过一个基于砜的氰基吡啶SNAr弹头桥连，弹头通过哌啶连接子与两端连接。合成路线涉及多步有机合成，包括Knoevenagel缩合、SNAr反应、Mitsunobu反应、酰胺偶联和氧化等关键步骤。2） 光谱表征与理论计算：使用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和核磁共振谱表征了化合物（包括模型化合物Coum、淬灭剂胺Q-amine和FRET二元体）的光物理性质。通过密度泛函理论（Density Functional Theory， DFT）和分子动力学（Molecular Dynamics， MD）模拟计算了优化几何结构、分子轨道和供体-受体距离，以支持实验观察到的FRET效率。3） 高通量反应活性测定：将测定流程适配至96孔板或384孔板格式，使用酶标仪在360 nm激发、410 nm发射处监测荧光随时间的变化。利用自动化液体处理平台（Opentrons OT-2）提高重现性和通量。在生理pH（如7.4）或更高pH（如8.3）的缓冲体系（如Tris或PBS，含10% DMSO助溶）中，测试FRET二元体对不同亲核试剂（如N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、N-乙酰赖氨酸、N-Boc丝氨酸、N-乙酰组氨酸）的反应，通过荧光信号增加和液相色谱-质谱联用验证反应进程与选择性。

**研究结果**
**1. 二元体的设计、合成与表征**
研究人员近期报道了基于砜的（杂）芳烃与半胱氨酸发生SNAr反应的结构-反应活性研究。为了简化流程，他们旨在开发一个基于FRET的高通量平台来评估弹头反应活性和稳定性。选择7-甲氧基香豆素作为供体荧光团，二硝基苯基暗淬灭剂作为受体，并引入哌啶连接子以促进最佳轨道排列并最小化可能由高度柔性连接子引起的重新定向事件。FRET二元体的合成路线如方案1所示，通过多步反应成功合成最终产物。

**2. FRET二元体的光谱学性质**
研究人员首先研究了Coum、Q-amine和FRET二元体在水溶液中的光谱性质。Coum的吸收带较宽，最大吸收在340 nm，摩尔吸光系数为21,700 M^-1 cm^-1。其发射光谱与吸收呈镜像关系，最大发射在402 nm附近，荧光量子产率较低（Φ_F = 0.0222）。Q-amine的吸收带由两个不同的电子跃迁组成：一个主吸收带中心在352 nm，一个次跃迁在416 nm处表现为肩峰。Coum的发射与Q-amine的吸收之间存在显著的光谱重叠，计算出的重叠积分为2.5 × 10¹⁴ nm⁴ M^-1 cm^-1。基于水中的实验数据，计算得到福斯特半径为21.3 ?。根据DFT几何优化得到的发色团间距离（18.8 ?），理论FRET效率估计为68%。然而，实验确定的92%效率表明这是一个更高效的过程。这种差异可能源于几个因素，例如取向因子和发色团间距离。分子动力学模拟显示平均供体-受体距离为15.9 ± 1.3 ?，据此估计的平均FRET效率为85%，与实验结果更为一致。理论计算支持了实验发现，分析表明FRET二元体在可见光区域的吸收谱主要由三个电子跃迁描述：S₀ → S₁ 和 S₀ → S₃与Q-amine部分相关，S₀ → S₅则完全与Coum相关。前沿分子轨道分析支持这一归属，且未观察到发色团间的电子混合，这与FRET机制主导的能量转移一致。

**3. FRET二元体对亲核试剂的荧光响应**
研究人员研究了FRET二元体对亲核试剂的荧光响应，以建立一个强大的测定平台。首先考察了最佳二元体浓度和缓冲液组成。使用N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽作为模型硫醇。在不同浓度（10–100 μM）的FRET二元体与过量亲核试剂（50当量）孵育1小时后，410 nm处的荧光强度与探针浓度成比例增加。液相色谱-质谱联用分析证实了芳基化硫醇加合物的形成和香豆素的释放。在50 μM和100 μM样品中检测到一个以530 nm为中心的更宽的发射带，可能与较高浓度下的聚集体形成有关。最终选择50 μM探针浓度用于后续测定。在不同缓冲液中，选择Tris进行进一步研究。建立了测定方法后，研究人员进行了二元体对N-乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽在低分析物浓度下的滴定实验。基于FRET的工作流程可轻松在自动化液体处理平台上实现，提高了测定重现性。监测Coum在410 nm处的发射随时间的变化超过2小时。荧光强度在添加后显著增加，并在孵育1小时后达到平台期，液相色谱-质谱联用分析证实了完全转化。反应速率随亲核试剂浓度线性增加，二级速率常数表明在pH 7.4下，谷胱甘肽（k₂ ≈ 0.62 M^-1 s^-1）的反应速度几乎是N-乙酰半胱氨酸（k₂ ≈ 0.37 M^-1 s^-1）的两倍。由于释放的淬灭剂可能导致分子间FRET，滴定Coum与增加浓度的Q-amine显示荧光浓度依赖性降低，这解释了最终信号减弱的原因。最后，研究人员研究了二元体对不同氨基酸的化学选择性谱，包括N-乙酰赖氨酸、N-Boc丝氨酸和N-乙酰组氨酸。在更高pH（50 mM PBS缓冲液，pH 8.3）下评估反应活性。除了两种半胱氨酸亲核试剂外，在任何氨基酸衍生物中均未观察到显著的荧光增加。空白与分析物之间荧光读数的微小差异对应于孵育4小时后二元体的部分水解，这在37°C下进行测定时更为明显，从而突出了SNAr弹头对半胱氨酸亲核试剂的选择性。

**讨论与结论**
研究人员开发了一种基于FRET的荧光测定法，用于评估共价弹头的反应活性。该平台允许在96孔板格式中平行筛选亲核试剂和测定条件（如缓冲液组成），提供定量动力学信息，同时减少了实验工作量。使用基于砜的SNAr亲电试剂作为模型弹头，该测定展示了对硫醇相对于其他亲核试剂的优异选择性，支持了其在生理相关条件下高通量分析亲电试剂反应活性的适用性。由于亲电试剂被纳入模块化的供体-弹头-淬灭剂设计中，这种方法可以很容易地扩展到其他共价弹头，包括丙烯酰胺和杂芳基砜。尽管溶液中的固有弹头反应活性并不能完全转化为蛋白质中的弹头反应活性，但这种方法通过能够直接评估共价反应动力学，为分析亲电试剂反应活性提供了一个实用工具。未来的研究将集中于应用此框架来系统评估不同亲电弹头类别的反应活性。除了化学生物学应用，这样的平台也可能支持药物发现中早期阶段共价弹头的优先排序。

**结论翻译**
研究人员开发了一种基于FRET的荧光测定法用于评估共价弹头反应活性。该平台允许在96孔板格式中平行筛选亲核试剂和测定条件（例如缓冲液组成），提供定量动力学信息，同时减少实验工作量。使用基于砜的SNAr亲电试剂作为模型弹头，该测定展示了对硫醇相对于其他亲核试剂的优异选择性，支持了其在生理相关条件下高通量分析亲电试剂反应活性的适用性。由于亲电试剂被纳入模块化的供体-弹头-淬灭剂设计中，这种方法可以很容易地扩展到其他共价弹头，包括丙烯酰胺和杂芳基砜。尽管溶液中的固有弹头反应活性并不能完全转化为蛋白质中的弹头反应活性，但这种方法通过能够直接评估共价反应动力学，为分析亲电试剂反应活性提供了一个实用工具。未来的研究将集中于应用此框架来系统评估不同亲电弹头类别的反应活性。除了化学生物学应用，这样的平台也可能支持药物发现中早期阶段共价弹头的优先排序。