一种用于加巴喷丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)测定的高水相HPLC-PDA方法：在药物分析、溶出度测定及法医筛查中的应用

《Frontiers in Chemistry》：A highly aqueous HPLC-PDA method for the assay of gabapentin and pregabalin: applications in pharmaceutical analysis, dissolution testing, and forensic screening

　　

摘要(Abstract)：加巴喷丁类(gabapentinoids)药物，特别是普瑞巴林(pregabalin, PGL)和加巴喷丁(gabapentin, GBP)，广泛用于治疗神经及精神疾病，但其滥用及相关法医检测挑战日益突出。该类化合物极性高、呈两性离子(zwitterionic)性质且缺乏强发色团，常需柱前衍生化或专用色谱系统，分析难度大。研究人员旨在开发并验证一种绿色、无需衍生化的高效液相色谱–光电二极管阵列检测(HPLC-PDA)法，用于同时测定制剂及查获样品中PGL和GBP。色谱分离采用Hypersil GOLD? C18柱(150 × 3 mm, 3 μm)，等度洗脱以水洗脱液:甲醇(96:4, v/v)为流动相，流速0.7 mL/min，检测波长205 nm；方法优化辅以23全因子实验设计，并按国际人用药品注册技术协调会ICH Q2(R2)指南验证线性、准确度、精密度、专属性、耐用性及灵敏度。结果显示，所建方法无需衍生化、缓冲盐体系或专用色谱柱即可实现有效分离，且较部分已报道方法减少有机溶剂消耗；校准曲线在5–60 μg/mL范围内呈线性(r ≥ 0.9997)，准确度95%–103%，日内及日间精密度(%RSD)低于5%，检出限/定量限分别为PGL 0.31/1.03 μg/mL、GBP 0.25/0.85 μg/mL；溶出试验证实药物快速释放并符合药典要求；应用于查获样品检出PGL含量超出标示量106%–110%，未观察到GBP对应色谱峰。结论：该方法简便、可靠且环境友好，可用于加巴喷丁类化合物的同时测定而无需复杂前处理，成功应用于药物分析、溶出度测试及法医样品检测，适用于常规实验室及监管监测。

本文解读基于发表于《Frontiers in Chemistry》的研究论文"A highly aqueous HPLC-PDA method for the assay of gabapentin and pregabalin: applications in pharmaceutical analysis, dissolution testing, and forensic screening"。

【研究背景与目的】

加巴喷丁(gabapentin, GBP)和普瑞巴林(pregabalin, PGL)属γ-氨基丁酸(GABA)结构类似物——即加巴喷丁类药物(gabapentinoids)，均含氨基和羧基呈两性离子(zwitterionic)特性，极性高、分子量小，在传统反相C₁₈柱上保留极弱；且因无强紫外发色团或天然荧光基团，已有文献多依赖柱前衍生化偶联荧光检测或采用专用色谱柱及高比例有机相缓冲液，前处理繁琐、溶剂消耗大，违背绿色分析化学(green analytical chemistry, GAC)原则。近年此类药物滥用及掺假现象增多，亟需能同时定量GBP与PGL、操作简便且适合药检与法医筛查的常规方法。研究人员据此开发并验证了无需衍生化、以高水相(96%水)等度洗脱的HPLC-PDA法，应用于市售胶囊制剂含量测定、溶出度(dissolution)测试及查获粉末样品的法医筛查。

【主要关键技术方法】

研究人员采用Thermo Scientific Hypersil GOLD? C₁₈柱(150 × 3 mm, 3 μm)，以超纯水:甲醇(96:4, v/v)为等度流动相，流速0.7 mL/min，柱温25 °C，进样量10 μL，PDA检测波长205 nm；经2³全因子实验设计(甲醇比例4%–6%、进样体积10–20 μL、流速0.7–1.5 mL/min)优化参数并以两化合物间色谱分离度(R)为响应；按ICH Q2(R2)进行专属性(空白/安慰剂/单标)、线性(5–60 μg/mL, n=3各水平)、LOD/LOQ(SD/slope法)、准确度(加标回收)、精密度(日内n=3三浓度、日间三分析员三批次)、耐用性(流速±0.1 mL/min、柱温±2 °C、波长±2 nm)及溶液稳定性(20 °C, 0–72 h)验证；溶出度测试按英国药典采用Apparatus 2(桨法, 50 rpm, 37 °C)分别以0.1 mol/L HCl(GBP)和0.06 mol/L HCl(PGL)为介质，取样稀释10倍后上机；制剂样品为沙特食药局(SFDA)提供的GBP(400 mg)及PGL(50/150 mg)胶囊，查获粉末样品同批来源经SFDA药品控制部提供，制备为水:甲醇(96:4)提取液过滤后进样；绿色度以AGREEPrep工具评估。

【研究结果】

3.1 Method optimisation(方法优化)

经筛选普通C₁₈、氰基及极性嵌入柱，选用Hypersil GOLD? C₁₈(高纯度硅胶双封端C₁₈)可减弱残留硅醇作用并获得对称峰形；比较乙腈、混合有机相及数种缓冲液(pH 3–5磷酸盐/甲酸盐/乙酸盐)后，确认水:甲醇(96:4, v/v)无缓冲体系给出最佳分离效率与UV响应——缓冲液会因改变电离态抑制205 nm处吸收。甲醇高于4%降低保留与分离度，故定为最低可行有机比例；流速0.7 mL/min慢于常规可改善传质与分离，柱温25 °C避免高水相气泡与基线漂移，稀释剂匹配流动相防止峰畸变；2³全因子设计确认最优组合为4% MeOH + 10 μL进样 + 0.7 mL/min，此时PGL与GBP分离度R=3.303，流速影响最大(效应?0.554)，其次为甲醇比例(?0.285)；高水相降低洗脱强度，使GBP环己基与PGL异丁基疏水性差异得以显现而产生保留差异。

3.2 Method validation(方法验证)

专属性试验空白与安慰剂无干扰峰，PGL保留时间(t_R)≈5.40 min、GBP≈6.52 min，最高浓度后注入空白残留信号<5%上限响应；线性范围5–60 μg/mL，回归方程PGL: y=507.83x?141.36 (r=0.9999)，GBP: y=570.49x?174.00 (r=0.9997)，截距不足上限响应的0.6%；LOD/LOQ按3.3×SD/S与10×SD/S计算得PGL为0.31/1.03 μg/mL、GBP为0.25/0.85 μg/mL；加标回收率PGL 95%–103%、GBP 95%–102%；日内%RSD≤2.0%、日间%RSD≤5.0%(n=3三浓度)；溶液20 °C放置72 h %RSD<3.0%且降解斜率统计不显著(p>0.05)， deliberate参数扰动下%RSD均<3.0%，方法耐用且稳定。未进行强制降解/峰纯度试验，验证限于所测基质(制剂与查获样)。

3.3 Application of the method to pharmaceutical formulation analysis(方法在药物制剂分析中的应用)

对含GBP 400 mg及PGL 50 mg胶囊按前述前处理测定，空白无干扰，混合工作浓度35 μg/mL测得PGL 35.81 μg/mL(准确度102.32%, %RSD 0.21)、GBP 34.55 μg/mL(准确度98.72%, %RSD 0.10)，表明方法可准确定量市售制剂中两成分。

3.4 Application of the method to seized samples analysis(方法在查获样品分析中的应用)

五份疑似加巴喷丁类粉末经相同前处理，均检出PGL特征峰且含量测定为标示量的106.03%–110.42%(超出BP95.0%–105.0%范围)，未见GBP保留时间处有色谱峰(低于LOQ 0.85 μg/mL或未含GBP)，提示查获品存在超量或配方不符情形。

3.5 Application of the method to dissolution testing(方法在溶出度测试中的应用)

按BP桨法以0.06 mol/L HCl(PGL)及0.1 mol/L HCl(GBP)为溶出介质，取样以水:MeOH(96:4) 10倍稀释中和酸性后进样。PGL 5 min溶出约58%，30 min达>98%；GBP 5 min溶出约90%，10–60 min维持94%–96%，均符合现行药典立即释放(immediate-release)制剂要求；二者f₂相似因子<50，溶出曲线不相似。

3.6 Comparison study(对比研究)

与文献报道相比(强阳离子交换柱、氰基柱、缓冲液高有机相、柱前/柱后衍生化荧光检测等)，本研究只用常规C₁₈柱、无缓冲、无衍生化、极低有机相(每针仅耗0.28 mL甲醇)，虽灵敏度不及荧光衍生化法(LOD约ng级)，但满足制剂QC与法医筛查需求，更具成本效益与普及性。

3.7 Greenness assessment using AGREEPrep(绿色度评估)

AGREEPrep评分0.45，优于多数文献方法；有机溶剂单针消耗较Ulu and Kel(2011)法降94.2%、较Khanage et al.(2014)法降96.0%，体现样品前处理简化与溶剂减量优势。

【讨论与结论总结】

研究人员建立了一种以水占96%(v/v)的高水相反相HPLC-PDA方法，可在常规C₁₈柱上不经衍生化或缓冲盐调节同时分离定量加巴喷丁(GBP)与普瑞巴林(PGL)，方法经验证符合ICH Q2(R2)全部要求，线性5–60 μg/mL、准确度95%–103%、精密度合格、LOD低至0.25–0.31 μg/mL。应用于市售胶囊含量测定结果与标示量吻合，溶出试验符合英国药典标准，查获样品中成功定量超标PGL且未检出GBP峰。相较既往需专用柱或衍生化方法，本法溶剂消耗降低逾94%，AGREEPrep绿色度评价较优，适合药企质量控制、监管机构及法医实验室常规高通量筛查使用。局限性在于UV 205 nm检测灵敏度不及衍生化荧光或MS/MS，不适用于生物检材痕量分析。