《Frontiers in Microbiology》：Persistent neurological and behavioral alterations after SARS-CoV-2 infection in an optimized K18-hACE2 mouse model
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摘要：引言：持续性神经系统症状是新冠肺炎后状态（Post-COVID-19 Condition，PCC，又称Long COVID）最常见且致残性最高的表现之一，影响全球数百万人群。PCC是一种慢性多系统综合征，约30%以上成年人在感染严重急性呼吸综合征冠状病毒
摘要：引言：持续性神经系统症状是新冠肺炎后状态（Post-COVID-19 Condition，PCC，又称Long COVID）最常见且致残性最高的表现之一，影响全球数百万人群。PCC是一种慢性多系统综合征，约30%以上成年人在感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）后出现。尽管其临床及社会经济学影响重大，PCC的生物学机制仍不明确，亟需稳健且具有转化价值的动物模型。方法：研究人员对K18-hACE2小鼠进行纵向研究，整合接种后至60天（dpi）的病毒学、免疫学、组织病理学及行为学评估。结果：SARS-CoV-2接种小鼠虽脑内未检测到病毒复制，但仍出现持续性神经行为学损害。这些改变与肺及神经组织持续性免疫失调、持续性肺部病变及迷走神经（vagus nerve）横截面积减小相关。值得注意的是，多项长期结局存在显著性别差异，与人PCC临床观察相符。讨论：研究结果表明K18-hACE2小鼠可重现PCC关键神经及免疫病理特征，可作为研究PCC相关神经系统后遗症的实验模型，并有助于靶向治疗干预措施的临床前评估。
论文解读：优化K18-hACE2小鼠模型中SARS-CoV-2感染后持续性神经及行为学改变研究
一、研究背景与意义
新冠肺炎后状态（Post-COVID-19 Condition，PCC或Long COVID）指SARS-CoV-2急性感染后出现并持续至少3个月的反复或多系统症状，约30%–40%感染者受累。其中神经系统及神经精神症状（neuro-PCC）尤为常见且致残，包括认知障碍、疲劳、焦虑、抑郁及自主神经功能紊乱等，但其机制不明且缺乏靶向治疗。传统K18-hACE2转基因小鼠因高剂量感染致严重神经侵袭及高死亡率，难以用于长期后遗症研究。为此，研究人员通过低剂量病毒接种优化该模型，在保障感染率并降低死亡率的前提下开展长达60天（dpi）的纵向随访，以模拟人类PCC的神经及系统改变。该研究发表于《Frontiers in Microbiology》。
二、主要关键技术方法概述
研究人员使用5–6周龄B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J（K18-hACE2）小鼠，经滴度优化确定101 TCID?? SARS-CoV-2 B.1谱系（Cat02株，含D614G突变）为感染剂量。设PBS阴性对照组与感染组，感染后监测存活率、体重、体温及临床评分。对存活小鼠于10、20、40、60 dpi分批剖检取鼻咽、肺、脑、迷走神经等组织；部分小鼠在基线及21、42、56 dpi进行筑巢实验（Nest Building Test，NBT）、挖洞实验（Burrowing Test，BT）、旷场实验（Open Field Test，OFT）及高架零迷宫实验（Elevated Zero Maze Test，EZMT），采用Δ值及z分数进行个体水平行为学分析。病毒基因组RNA（gRNA）用RT-qPCR靶向UpE基因检测；组织行HE染色与SARS-CoV-2核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋白免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）；迷走神经横截面积（Cross-Sectional Area，CSA）用图像分析软件量化；肺、脑及血浆细胞因子用Luminex多重检测；60 dpi脾细胞做γ-干扰素酶联免疫斑点实验（IFNγ ELISpot）检测T细胞应答；血浆用cPass法测中和抗体；统计采用重复测量方差分析及个体z分数判定（|z|≥1.96为受损）。
三、研究结果
3.1 Consistent acute disease with reduced mortality following low-dose SARS-CoV-2 inoculation（低剂量SARS-CoV-2接种后急性疾病一致且死亡率降低）
通过剂量爬坡实验确定101 TCID??可在诱导稳定感染与可检测临床症状的同时将总存活率提升至约60%（雌性68%，雄性53%）。死亡多发生于5–12 dpi且均伴脑部病毒复制与高病毒载量；进入纵向分析队列的存活小鼠脑内各时间点均未检出病毒gRNA、活病毒或N抗原，亦无脑炎组织学证据，表明后续观察为无中枢神经持续感染的急性感染后后遗症。
3.2 Time- and sex-dependent clinical manifestations throughout the study period（全程出现时间及性别依赖的临床表型）
急性期（7–8 dpi）雄性临床评分显著高于雌性；恢复期（40、47 dpi）雌性临床评分高于雄性。体重在急性期（4–9 dpi）感染组显著降低且雄性更明显，恢复期47 dpi仍有轻微差异。皮下温度各组无差异。
3.3 Time- and sex-dependent behavioral impairments following SARS-CoV-2 infection（SARS-CoV-2感染后出现时间及性别依赖的行为学损害）
组水平Δ值无显著差异，但个体z分数分析显示部分感染鼠存在持续性探索及焦虑相关行为受损：雌性主要表现为OFT中心区距离比及停留时间降低（z＜?1.96，10/15雌鼠），雄性主要表现为EZMT开放臂进入次数减少（5/10雄鼠）。受损个体比例在21 dpi为12/25、42 dpi为9/25、56 dpi为14/25，且随时间和性别表现模式不同，模拟了人neuro-PCC的异质性与波动特征。BT与总移动距离无组间差异，排除一般运动功能障碍。
3.4 Persistence of SARS-CoV-2 gRNA in respiratory tissues and pulmonary lesions（SARS-CoV-2 gRNA在呼吸道组织持续存在及肺部病变）
肺组织gRNA持续检出至20 dpi，鼻甲骨至40 dpi，60 dpi个别鼠鼻甲骨弱阳性；脑及其他肺外组织全程阴性。肺组织可见持续轻度支气管周围淋巴细胞增生（peribronchial lymphoid hyperplasia）直至60 dpi，无活病毒及N蛋白检出，提示炎症未完全消退而非持续复制。
3.5 Long-term reduction in vagus nerve cross-sectional area following SARS-CoV-2 inoculation（SARS-CoV-2接种后迷走神经横截面积长期缩小）
感染组颈段迷走神经CSA在20、40、60 dpi均低于对照组，60 dpi达统计学显著（p＜0.05），提示潜在自主神经通路结构性改变。
3.6 Time- and sex-dependent cytokine dynamics in lung and brain after SARS-CoV-2 inoculation（SARS-CoV-2接种后肺与脑组织因子呈时间及性别依赖性动态变化）
肺：10 dpi促炎因子（IFNγ、TNFα、CXCL10等）上调，20 dpi下调但TNFα仍高，40 dpi接近基线，60 dpi部分雄性再现多因子上调。脑：10 dpi多数因子持平或略降，60 dpi部分个体（雌雄均有）出现IL-2、RANTES、MIP-1α上调，组水平显著升高。血浆细胞因子全程无变化。
3.7 Sustained adaptive immune responses following SARS-CoV-2 inoculation（SARS-CoV-2接种后适应性免疫应答持续存在）
中和抗体自20 dpi升高并维持至60 dpi（个体间差异大）；60 dpi脾细胞对刺突（S）蛋白IFNγ ELISpot反应强于核衣壳（N）蛋白，雌性略高于雄性，但未达组水平显著差异。
3.8 Acute phase disease severity predicted long-term immune and neurocognitive outcomes in a sex-dependent manner（急性期疾病严重程度以性别依赖方式预测长期免疫及神经认知结局）
雄性急性期严重程度与60 dpi肺促炎因子水平、中和抗体滴度及迷走神经CSA减小正相关；雌性急性期严重程度与60 dpi脑CRP浓度、中和抗体及OFT中心区表现受损（21、42、56 dpi）正相关。
四、讨论与结论总结
讨论指出本优化K18-hACE2模型以低剂量B.1株实现60 dpi纵向追踪，存活鼠脑内无持续病毒复制却出现持续性神经行为损害、肺与脑免疫失调、肺病理持续及迷走神经CSA减小，且呈现与人PCC一致的性别差异（雄性强急性期、女性高发长期神经症状）。个体水平分析揭示异质性亚群，呼应PCC临床亚型。与仓鼠模型比较，本模型长期改变更多源于宿主持续免疫失调而非残留病毒RNA持续存在。局限性包括小鼠脑结构差异、行为学未涵盖记忆/认知灵活性及迷走神经未做详细组织学/功能验证。
结论（翻译）： 本研究表明，经优化低剂量SARS-CoV-2感染的K18-hACE2小鼠在脑内无可检测病毒复制的情况下，仍出现符合PCC特征的持续性神经行为学损害、肺及神经免疫失调、持续性肺部病变及迷走神经横截面积减小。雌性及急性期临床严重程度是长期结局的主要预测因子。该优化模型重现了人类PCC关键神经及免疫病理特征，可作为研究neuro-PCC发病机制及评估靶向治疗策略的相关实验框架。
