基于银覆盖纳米结构基底的拉曼映射：一种快速评估人体全血死后间隔的创新方法

《International Journal of Legal Medicine》：Raman mapping on Ag-covered nanostructured substrates as an innovative approach for rapid estimation of post-mortem interval on human whole blood

　　

人体尸体早期死后间隔（PMI）的估计仍然是法医学面临的一项挑战。研究人员通过利用在创新的纳米结构表面增强拉曼散射（SERS）基底上直接沉积未经处理的人体全血进行无标记拉曼映射，提出了一种新方法，以快速获取作为死后生化标志物（BPM）的次黄嘌呤（Hx）不同存在水平的信息。该方法的有效性在来自人体尸体的多个全血样本上进行了测试，时间窗口覆盖死后3至32小时。该方法能够识别Hx浓度增加的代谢和内源性来源，可以进一步设计用于开发专用的可自动化设备，并在医学和法医现场检查与调查中具有现场应用的潜力。

**论文解读：基于SERS增强拉曼映射快速评估人体全血死后间隔**

**研究背景与意义**
在法医学和刑事调查中，准确估计死后间隔（PMI）至关重要。传统方法主要依赖于观察尸体温度下降、尸斑和尸僵等物理变化，其中体温下降评估的可靠性相对较高。这些方法基于经验模型，并满足法庭科学证据采纳的Daubert标准。然而，传统方法仅适用于较短的PMI（例如死后数小时），且可能受到生前高/低温等内在变量的影响。对于更长的PMI（数周至数年），则需依赖同位素方法、DNA降解或法医昆虫学等技术。免疫组织化学（IHC）技术也可在死后前两周提供额外的PMI信息。

近年来，PMI估计的新方法侧重于分析死后生化标志物（BPMs）的变化，涉及死后生物化学（单变量分析）或代谢组学（多变量分析）。这些新方法有望扩展死亡时间估计的时限，若与传统基于体温的列线图结合使用，可提高PMI评估的准确性和可靠性。生化分析包括大分子（如核酸和蛋白质）降解的测量以及体液代谢组学成分死后变化的监测。已有研究在血浆、血清、玻璃体液（VH）、房水（AH）、脑脊液、心包液和滑膜液等多种体液中，发现钠、钾、氯、氨、磷酸盐、乳酸、次黄嘌呤（Hx）、胆碱、甘油、牛磺酸、琥珀酸、尿素、尿酸和肌酐等化合物可能作为BPMs。

其中，次黄嘌呤（Hx）作为人体嘌呤分解代谢的中间产物，是腺苷三磷酸（ATP）的降解产物。生前，在生理条件和充足氧气下，Hx被黄嘌呤氧化酶（存在于哺乳动物肝脏和小肠黏膜）氧化为尿酸，后者是人体嘌呤代谢的最终排泄产物。而在血液中，由于血管和血液中缺乏黄嘌呤氧化酶，嘌呤分解代谢的终产物是Hx。在组织缺氧情况下，由于一磷酸腺苷（AMP）增加、Hx向尿酸的转化减少以及黄嘌呤氧化酶活性受抑制等机制，Hx的代谢途径被减弱或阻断。因此，Hx是BPM的一个有潜力的候选者，预计其浓度在死后会因缺氧生物基质中能量依赖性嘌呤分解代谢中断而增加。

文献报道大多基于动物研究（因获取人体死后样本存在实际困难），结果表明与其他BPMs相比，Hx与PMI的相关性更强，且受环境温度等外部因素的影响较小，时间窗口可超过24小时。除骨骼和心包液（其中检测到Hx浓度随时间下降）外，科学文献证实通过回归模型，在所有生物体液中（最长至100小时），Hx增加与PMI预测具有可靠性。在血浆/血清、VH、AH和脑脊液（CSF）中均观察到Hx随时间（VH中可达120小时）增加的一般行为，其中解剖学上隔离的生物基质（主要是VH）因其自溶变化较慢且免受外部物理生化条件影响，能提供更可靠的PMI估计。

然而，详细研究尚未广泛开展，且除VH外，Hx揭示的趋势可能的线性关系尚未得到充分和广泛的证实。此外，用于量化Hx的生化方法，如高效液相色谱（HPLC）、核磁共振（NMR）和质谱（MS），相当复杂、昂贵且耗时，或需要样本制备和特异性荧光标记（如酶学检测）。因此，需要开发一种快速、简单且无需复杂样品前处理的新方法。

**研究方法概述**
本研究提出了一种全新的方法，利用在创新的纳米结构表面增强拉曼散射（SERS）基底上直接沉积人体尸体全血进行无标记拉曼映射，以快速获取作为BPM的Hx不同水平的信息。研究采用了基于银覆盖硅纳米线（Ag/SiNWs）无序阵列的SERS平台，该平台具有制备成本低、无需精确调控纳米结构尺寸以及直接滴注样品分析方法简单等优点。样本来源于15具已知PMI（死后3至32小时）的人体尸体全血，通过股沟大血管穿刺采集，未经化学处理或抗凝剂处理，储存于-18°C，分析前解冻并直接滴注于SERS基底。拉曼分析使用532 nm激光，在血清分离区域进行映射，通过计算724 cm^-1（Hx特征峰）与750 cm^-1（血红素基团特征峰）的强度比值R作为PMI标志物。

**研究结果**
**SERS基底与样本分离效应**
SEM表征显示所使用的SERS基底为Ag/SiNWs无序阵列。当全血滴注于基底并干燥后，观察到基底自然诱导了部分离心效应：液体成分（血清）积聚在干燥液滴边缘，而固体成分（红细胞、白细胞和血小板）则留在中心。这种物理分离使得能够在液滴边缘的血清富集区域进行拉曼映射，减少了血红蛋白的光谱干扰，从而有利于识别低浓度生物分子如Hx。

**拉曼光谱分析与比值R的确定**
在血清区域获得的平均拉曼光谱中，可识别出位于约724 cm^-1的Hx特征峰和750 cm^-1的血红素特征峰。研究计算了15个样本的R值（Hx峰强度/血红素峰强度）。结果显示，R值随PMI的变化呈现非线性的特征行为，而非简单的渐进增加。根据R值的变化趋势，可识别出三个不同的时间范围：死后3至6小时、6至10小时以及10小时以上。

**R值随PMI变化的三个阶段**
* **第一阶段（3-6小时）**：R值初始值约为1（两峰强度相近），随后出现下降。
* **第二阶段（6-10小时）**：R值达到峰值，超过阈值1.5（约在PMI 6小时处）。
* **第三阶段（>10小时）**：R值再次下降并趋于稳定，保持在阈值0.5以下。同时，总体拉曼信号强度也出现下降。

**对非线性行为的解释**
这种非线性行为可能与细胞水平的死亡过程非瞬时性有关。死后初期，细胞可能仍存在生化延迟和细胞内嘌呤分解代谢产物的区室化，这反映在R值的初始上升趋势中。随后，当溶血占主导时，血液中Hx积累加速，R值行为发生改变。在更高PMI时，由于组织开始腐烂、Hx前体耗竭以及分子振动结构降解，总体拉曼强度显著降低，R值最终下降并稳定在较低水平。

**样本储存影响评估**
研究评估了室温（RT）储存对样本分析的影响。对于PMI为20小时的样本，新鲜样本的R值正确地位于0.5阈值以下，但在试管中RT储存24小时后，R值增加了约3倍。这表明，尽管在无冷藏条件下细胞裂解释放出更多Hx和血红蛋白，但本方法基于对富集轻质成分的血清进行拉曼分析，能够揭示体外RT老化过程中Hx的增加。同时，研究发现血液RT储存后振动信号变化较小，这可能是因为试管中缺乏导致腐败过程的细菌，或先前血液样本的冷藏削弱了其作用。

**讨论与结论**
**讨论**
本研究首次将拉曼光谱应用于直接从人体尸体全血中估计早期PMI。所提出的方法能够追踪未经处理的人体尸体全血样本中Hx的存在，并观察到死后最初几小时内Hx水平的快速非线性演化。这是一种完全基于光谱学的方法，通过无标记、快速、简单的分析程序，为PMI估计提供了一个补充工具。该方法潜在适用于分析其他人体生物基质，且不受样本密度等参数影响，也不受红细胞血红蛋白等干扰污染物的阻碍。因此，它克服了甚至在对解剖学隔离的生物体液（如VH）进行分析时报告的一些评估问题。

尽管拉曼光谱具有高选择性、可重复性、无需扫描前制备、非破坏性以及潜在便携性等优势，且满足Daubert标准，但其在法医病理学中仍未得到充分探索，也未常规用于PMI估计。本研究首次将该技术应用于早期PMI估计和人体尸体全血分析。

未来工作需要扩大案例研究数量，以证实所得结果，并探究其与供体特征（如年龄、死因、生物学背景、生活方式、用药、环境温度/条件、性别等）以及生前导致缺氧的病理状况（这肯定会影响死后Hx生化途径）之间的可能相关性。进一步的研究目的还包括通过分析更长的死后时间窗口（超过32小时），广泛评估本分析方法的潜力，验证Hx在中等PMI中是否也表现出特征性行为。

**结论**
研究人员提出了一种基于全血拉曼映射的新方法，借助创新的SERS基底，快速获取血清中作为BPM的Hx不同水平的信息。该方法仅需将几微升样本沉积并干燥在Ag/SiNWs无序阵列上。基底既能诱导自发的离心效应分离血清与细胞成分，又能增强来自分离血清的散射信号。从血清区域采集的拉曼映射平均光谱中计算724 cm^-1（归属于Hx）与750 cm^-1（归属于血红素基团）的振动峰强度比值R，并将其用作PMI的特定指标。该程序在来自15具已知PMI（死后3至32小时）的尸体未经处理的人体全血样本上进行了测试，识别出三个不同的时间范围：3至6小时（R值从1开始下降）；6至10小时（R值超过阈值1.5）；以及10小时以上（R值再次下降并稳定在阈值0.5以下）。本方法提供了一种途径，可在死后最初几小时内追踪未经处理的人体尸体全血样本中Hx水平的快速非线性演化，并以无标记、快速和简单的方式估计PMI。此外，由于整个程序的快速性和SERS基底的独特性质，可以专注于血清成分的分析，并减少与样本储存期间红细胞损伤相关的Hx浓度内源性增加的干扰。这一通过全光学方法获得的显著结果，与标准和便携式光谱学及硅技术兼容，从而为医学和法医现场检查与调查中的前瞻性现场应用奠定了基础，同时为未来的设备工程化和自动化铺平了道路。