活体小鼠经颅脑成像的光学窗口：颅骨削薄、光学透明化及其他技术

《Advanced Science》：Optical Windows for Transcranial Brain Imaging in Living Mice: Skull Thinning, Clearing, and Beyond

　　

纵向无创活体成像对于研究脑生理学和病理机制至关重要。经颅光学窗口技术的进展，包括颅骨削薄和光学透明化技术，在与多光子显微镜结合时，显著提高了成像深度和分辨率。然而，其光学性能通常会迅速恶化，关于长期稳定性及图像质量下降原因的定量研究仍然有限。本研究利用多光子激发荧光显微镜（MPEFM）和自适应光学技术，系统研究了当前的经颅窗口方法，考察了其寿命、成像质量和光学像差。这些结果表明，进行性的颅骨再生是所有类型窗口的根本限制，导致信号质量和分辨率显著下降。为了应对这些挑战，研究人员开发了一种局部递送糖皮质激素（GC）的策略，可将窗口性能显著延长至一个月。此外，研究表明，负载GC的水凝胶密封方法能有效抑制颅骨再生，同时保持最佳光学特性，为慢性、高保真度的经颅成像提供了一条潜在且实用的途径。这些发现为窗口性能退化的机制提供了见解，并为持续、长期的活体脑成像建立了框架。

### **活体小鼠经颅脑成像光学窗口技术研究解读**

**研究背景与问题**

在神经科学领域，多光子显微镜（MPM）已成为可视化活体大脑深部精细细胞结构和动态细胞间相互作用的核心工具。其重复、无创的活体成像能力使得对神经功能、疾病进展和治疗效果的长期详细研究成为可能。然而，颅骨不透明且浑浊的结构引入的光学散射和像差常常会损害图像质量，限制了分辨率和穿透深度。开颅骨窗是最常用的方法，可实现纵向高质量成像，但其具有侵入性，可能导致炎症反应、胶质细胞活化、神经连接永久性改变以及脑脊液动力学紊乱等并发症。

为了解决这些问题，多种光学窗口技术被提出和发展。颅骨削薄窗口通过仅移除颅骨外表面层，同时保留下方薄层，最大程度地减少对大脑的干扰。为了延长成像持续时间和扩大视场（FOV），研究者引入了抛光加固颅骨削薄（PoRTS）窗口。光学透明化（OC）窗口则通过化学方法去除脂质、胶原蛋白并使颅骨折射率（RI）匹配，从而在不削薄颅骨的情况下实现光学透明，减少散射并增强透明度。OC窗口允许更大的成像区域，同时保持机械稳定性，这对于需要保留颅骨完整性作为脑膜中髓样细胞储存库的实验至关重要。尽管这些非侵入性窗口代表了脑成像领域的重大进展，但很少有研究从成像深度和光学像差的角度定量评估其性能。此外，关于窗口寿命的研究有限，而这对于需要数周至数月纵向观察的长期活体实验至关重要。这种信息的缺乏阻碍了研究人员为活体脑成像选择最合适的光学窗口。因此，系统评估不同经颅窗口的长期稳定性、光学性能及限制因素，并探索延长其有效寿命的方法，具有重要的科学意义和应用价值。

**研究概况与主要结论**

本研究由Y.F.、 G.Y.、 Z.S.和J.Y.Q.等人合作完成，旨在全面评估四种经颅窗口（颅骨削薄窗、PoRTS窗、OC窗以及结合两者优点的削薄-透明化（TC）窗）的成像持续时间、光学像差以及高分辨率成像能力。研究利用传统的双光子激发荧光显微镜（TPEFM）和先进的自适应光学（AO）-TPEFM技术，系统揭示了颅骨再生是限制所有类型窗口长期性能的根本原因。研究人员进一步开发了局部应用糖皮质激素（GC）抑制颅骨再生的策略，成功将窗口有效成像时间延长至一个月，并探索了负载GC的水凝胶作为密封材料，为实现慢性、高保真度的经颅成像提供了新途径。该研究成果发表在《Advanced Science》期刊上。

**关键技术方法概述**

本研究主要采用了以下关键技术方法：
1. **动物模型与手术制备**：研究使用成年Cx3cr1^GFP/+转基因小鼠，其小胶质细胞在生理条件下稳定表达绿色荧光蛋白（GFP），可用于监测窗口制备引起的潜在炎症，并为评估成像深度和分辨率提供稳定的荧光源。研究严格按照已发表的方案，制备了颅骨削薄窗、PoRTS窗、OC窗和TC窗。
2. **多光子显微成像系统**：研究采用标准双光子激发荧光显微镜（TPEFM）进行常规成像，并使用基于波前传感器的自适应光学双光子显微镜（AO-TPEFM）以及先进的ALPHA-FSS双光子系统进行高分辨率、深部脑成像和像差测量。其中，ALPHA-FSS系统结合了直接焦点传感、共轭自适应光学和远程聚焦模块，能够稳健地校正样本引起的像差和散射。
3. **信号定量与分析方法**：为了定量比较不同窗口的成像质量，研究人员建立了统一的数据采集和图像形成流程。通过测量不同深度下小胶质细胞GFP的荧光强度，拟合其与深度的对数线性关系，利用截距I₀来定量代表整个成像体积的全局荧光信号强度。同时，通过测量小胶质细胞突起的对比度来定义具有足够分辨率的成像深度。
4. **颅骨再生抑制策略**：为了延长窗口寿命，研究人员测试了局部应用商业糖皮质激素软膏（地塞米松、氢化可的松）以及不同浓度的地塞米松溶液（通过医用海绵或水凝胶载体递送）对颅骨再生的抑制作用，并评估了其对小胶质细胞形态和位置的影响。

**主要研究结果**

**2.1 用于活体小鼠脑多光子显微镜的经颅窗口**
研究人员首先使用标准TPEFM研究了各种经颅窗口的光学特性。通过纵向成像发现，所有四种窗口（颅骨削薄窗、PoRTS窗、OC窗、TC窗）在21天内均出现GFP信号的快速下降，尤其是在深部脑区的精细小胶质细胞结构。这种信号衰减与内层颅骨表面二次谐波产生（SHG）信号的显著增厚相一致。利用三光子显微镜进行的三次谐波产生（THG）成像证实，新出现的SHG信号对应于再生的骨组织，新骨结构起源于原始骨基底部。这表明，所有经颅窗口的光学透射性能下降均归因于颅骨再生。研究还发现，对于颅骨削薄窗，使用硅胶（Kwik-Cast）密封会导致硬脑膜炎症和大量GFP阳性细胞的募集，从而迅速降低成像质量，而使用UV胶（Kafuter 303）密封则可避免此问题。对于OC窗，当相对年老小鼠的海绵状骨中存在血管结构时，透明化效果有限。而TC窗（结合削薄和透明化）不仅将透明化时间从约1小时缩短至约10分钟，而且与单独的颅骨削薄窗或OC窗相比，显著提高了脑荧光信号强度（约1.7倍）。

**2.2 经颅窗口的光学特性：荧光强度、分辨率和像差**
通过定量比较，研究发现PoRTS窗的荧光强度与初始颅骨削薄窗相比没有显著差异。OC窗的荧光强度在应用透明化处理后甚至低于颅骨削薄窗。相比之下，TC窗提供了最佳的荧光强度。在具有足够分辨率的成像深度方面，颅骨削薄窗、PoRTS窗和OC窗之间没有显著差异（平均深度120-150微米），而TC窗则显著提高了成像深度（约200微米）。利用基于波前传感器的AO-TPEFM测量像差发现，尽管TC窗显示出更好的荧光强度和成像深度，但各窗口类型之间的波前误差（峰谷值P-V和均方根值RMS）没有显著差异。值得注意的是，像差随着成像深度显著增加，这与深部区域分辨率的快速恶化相一致。模拟分析表明，对应于较大组织结构的积分点扩散函数（PSF）值对像差的敏感度低于其峰值强度，这解释了小胶质细胞胞体在深部组织中强度衰减较慢的原因。

**2.3 使用ALPHA-FSS在经颅窗口上进行高分辨率深部脑成像**
研究表明，标准TPEFM下，所有经颅窗口引入的像差和散射将高分辨率成像深度限制在约200微米左右。使用先进的ALPHA-FSS双光子系统可以有效补偿样本引起的像差，从而显著提高小胶质细胞突起的荧光强度，使得在TC窗下能够清晰可视化440微米以深的最精细小胶质细胞结构。在其他窗口类型上也实现了类似的分辨率和成像深度改善。然而，随着颅骨再生的进行，GFP荧光信号大幅衰减，ALPHA-FSS补偿颅骨引起像差的能力变得越来越有限，校正效率和最大成像深度均显著降低。

**2.4 抑制颅骨再生的长期经颅窗口**
鉴于颅骨再生是限制窗口寿命的主要因素，研究人员探索了抑制再生的方法。局部应用商业糖皮质激素软膏（地塞米松或氢化可的松）能有效抑制颅骨再生超过四周，相应地，GFP信号强度保持稳定。但高浓度的GC会渗透脑膜，影响浅层皮层（<60微米）小胶质细胞的形态（增加分支指数和监视面积）和空间位置（减少静态细胞，增加动态细胞）。通过降低地塞米松浓度，研究人员发现0.0135%的中等浓度（约为商业软膏浓度的1/10）仍能成功抑制再生长达28天，且在此浓度下，地塞米松不再改变浅层皮层小胶质细胞的形态，深部脑区的小胶质细胞也未受影响。虽然浅层皮层静态小胶质细胞比例仍高于70%，但在60微米以深未观察到小胶质细胞位置的统计学显著变化。这表明地塞米松对小胶质细胞的影响是剂量依赖性的，精心控制的较低浓度可以最大限度地减少其对脑组织的影响。最后，研究人员开发了一种负载地塞米松（0.0135%）的透明水凝胶（基于甲基丙烯酰化透明质酸HAMA和光引发剂LAP）作为窗口密封材料。该水凝胶窗保持了高透明度，且能有效递送地塞米松抑制颅骨再生超过28天，同时未检测到小胶质细胞形态和空间分布的可察变化。然而，现有商业水凝胶存在脱水收缩问题，需要每3-4天更换以维持成像质量。

**讨论与结论**

**讨论部分总结：**
经颅脑成像光学窗口是研究小鼠模型脑生理和疾病的关键技术。本研究通过定量评估不同经颅窗口的成像持续时间以及使用先进自适应光学双光子显微镜可实现的成像深度，解答了关于窗口有效寿命和高分辨率成像深度的基本问题。研究强调了成像质量受多种因素影响，包括颅骨厚度、小鼠年龄和手术精度。研究的关键见解包括：1) 颅骨再生是所有经颅窗口长期性能的根本限制机制；2) 对于颅骨削薄窗，密封材料的选择至关重要，硅胶密封可能导致硬脑膜炎症；3) TC窗在荧光强度和成像深度方面表现最佳；4) 局部递送糖皮质激素可有效抑制颅骨再生，延长窗口寿命至四周；5) 负载地塞米松的水凝胶可作为有效的密封剂，同时抑制再生和保持光学透明性。

研究还深入探讨了颅骨再生的可能机制。由于窗口制备过程中移除了浅层致密骨的骨膜，而内骨膜保持完整，这可能解除对Wnt/β-连环蛋白通路的抑制，促进成骨细胞活性。此外，光学透明化剂的化学应激或削薄手术的机械损伤可能刺激硬脑膜释放成骨因子。这些因素共同导致了从剩余骨内表面起源的颅骨再生。对于糖皮质激素，其抑制骨生长的副作用被用于抑制颅骨再生。然而，由于GC分子量小，可能渗透血脑屏障影响脑组织，因此需要寻找合适的浓度以平衡抑制效果和神经影响。长期暴露可能导致糖皮质激素抵抗。未来的研究方向包括寻找能特异性抑制骨再生且局限于颅骨内、不影响脑膜和大脑的药物化合物，以及开发具有抗脱水特性、可实现更长维护周期的水凝胶材料。

**结论部分翻译：**
本研究系统评估了多种经颅光学窗口的长期性能和光学特性，揭示了颅骨再生是其共同的根本限制。研究人员开发了局部糖皮质激素递送策略，成功将窗口有效成像时间延长至一个月，并证明了负载GC的水凝胶密封方法的可行性。这些发现为理解窗口退化机制提供了见解，并为实现持续、长期的活体脑成像建立了框架。