小胶质细胞激活过程中的质膜重塑：一个连接小胶质细胞形态与脂滴形成的假说

《GLIA》：Plasma Membrane Remodeling During Microglial Activation: A Hypothesis Linking Microglial Shape and Lipid Droplet Formation

　　

摘要：小胶质细胞是动态细胞，在急性脑损伤和慢性神经退行性疾病中会发生转录和形态上的反应。激活后，它们的分支减少，变得更圆，并积累细胞内脂滴（LD）。在这篇假说论文中，研究人员提出，这些脂滴的形成支持了形态重塑过程中所需的质膜脂质重新分布。该假说基于对衰老、急性激活和慢性激活条件下小胶质细胞形态的原始研究和已发表研究。在离体脑切片中，小胶质细胞在几分钟内对ATP或急性Aβ注射做出反应，将其近端突起伸向刺激源，同时将远端突起缩回胞体。在淀粉样蛋白小鼠模型中，长期暴露于Aβ会减少小胶质细胞分支，同时伴随表面积减少两到三倍。转录组分析表明，激活的小胶质细胞上调了参与脂肪酸合成和脂肪酸活化的基因，这两个过程对于三酰甘油（TAG）的生成都是必需的。整合这些新的和已发表的小胶质细胞分析，研究人员提出了一个假说：在急性激活期间，质膜磷脂被重新分布；在慢性激活期间，它们被代谢为三酰甘油并进入脂滴。通过多种药理学和遗传学方法检验这一假说，将有助于理解经历显著形态变化的细胞中的脂滴。

**论文解读：小胶质细胞激活过程中的质膜重塑与脂滴形成**

**研究背景与意义**
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中重要的免疫细胞，在维持大脑稳态、应对损伤和参与神经退行性疾病进程中发挥关键作用。晚发型阿尔茨海默病（AD）的多个遗传风险因子与脂质代谢和脂质转运功能相关，其中载脂蛋白E（apoE）基因的等位基因影响最为显著。APOE4等位基因增加AD风险，而APOE2及罕见等位基因（如Christchurch和Jacksonville）则具有保护作用。脂质代谢紊乱最初被认为是AD的标志之一，近期研究也聚焦于脂质生物学在AD风险、发病机制和进展中的破坏作用。在中枢神经系统中，apoE影响脂质代谢的许多方面，包括脂质摄取、外流和储存。脂质储存可以以脂滴（LD）的形式存在，这是一种由磷脂单层膜包裹疏水中性脂质核心的细胞器。APOE4基因型与培养的小胶质细胞以及人脑中更高水平的脂滴相关。小胶质细胞执行许多与AD中神经退行性变相关的功能，如促进炎症过程、吞噬髓鞘碎片和凋亡细胞、以及监测和修剪突触。遗传和转录组学关联暗示小胶质细胞脂质代谢可能影响AD的发病或进展。在衰老和AD条件下激活的小胶质细胞中会积累脂滴，这些情况也与小胶质细胞形态的显著变化相关。因此，理解小胶质细胞形态变化与脂质代谢重塑之间的关联，对于揭示神经退行性疾病的细胞机制具有重要意义。

**研究方法概述**
本研究综合运用了多种技术方法来验证关于小胶质细胞质膜重塑与脂滴形成的假说。首先，研究人员使用了携带CX3CR1-GFP报告基因的转基因小鼠（包括APOE3和APOE4基因型，以及与5XFAD淀粉样蛋白模型小鼠的杂交品系）作为模型，样本来源于4-6月龄的雄性和雌性小鼠。其次，通过离体脑切片实验，利用显微注射ATP或荧光标记的Aβ₄₂，并结合延时活细胞成像技术，实时观察和分析了小胶质细胞对急性损伤信号的形态动力学反应。第三，采用共聚焦显微镜对固定脑组织切片中的小胶质细胞进行高分辨率成像，并利用Imaris软件进行三维形态学重建，定量分析细胞体积、表面积、表面积与体积比以及分支复杂性（分支指数）。第四，对已发表的转录组数据集（包括人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞经LPS或Aβ处理的数据，以及小鼠小胶质细胞的数据）进行了深入的生物信息学再分析，包括功能富集分析、特定脂质代谢基因集的表达变化分析，以及脂滴累积小胶质细胞（LDAM）特征基因的鉴定与比较。最后，整合并分析了已发表的脂质组学数据，以评估Aβ激活对小鼠原代小胶质细胞中各类脂质物种丰度的影响。

**研究结果**
**3.1 ATP和Aβ诱导的急性小胶质细胞形态变化**
研究人员先前利用离体脑切片研究了小胶质细胞形状如何响应急性损伤信号（ATP和Aβ）。使用药理学抑制剂表明，两种刺激都通过稳态受体P2RY12信号通路激活小胶质细胞。当通过玻璃移液管施加ATP时，小胶质细胞突起在几分钟内朝向移液管方向延伸，并在30分钟时在移液管部位出现强烈聚集。除了早期研究中注意到的这种近端效应外，研究人员观察到一个更新颖的现象：背向移液管方向的小胶质细胞突起以与突起延伸相似的时间尺度缩回小胶质细胞胞体。这种动态重排过程在不同脑切片中一致观察到。在对荧光Aβ₄₂的反应中也观察到类似的响应：在45分钟内，靠近Aβ₄₂的突起伸向刺激源，而远端突起则缩回胞体。

**3.2 小胶质细胞形态中的质膜差异**
研究人员提出，小胶质细胞突起的这种重排可能允许每个细胞有限的质膜总量得以保存。为探究慢性淀粉样蛋白病理是否影响小胶质细胞形态，他们通过MOAB2抗体免疫组化鉴定淀粉样斑块，并将小胶质细胞分为靠近斑块或远离斑块两类。分析发现，远离斑块的小胶质细胞比靠近斑块的小胶质细胞显著更复杂。这些远处、形态更复杂的细胞表现出比斑块近端小胶质细胞高⁵⁰%的表面积。细胞体积本身与细胞复杂性的分支指数测量值无关，而表面积与体积比则与分支指数强烈相关。因此，形态更简单的细胞也具有显著更少的质膜表面积。

**3.3 小胶质细胞激活的分子分析**
研究人员假设，三酰甘油将由重塑的质膜磷脂通过两步合成：（1）从甘油骨架上移除磷酸头部基团，（2）添加第三条脂肪酸侧链。对已发表的原代小鼠小胶质细胞经Aβ激活后脂质组学变化数据的分析支持了这一假设：质膜中丰富的脂质——磷脂酰胆碱和鞘磷脂——的水平显著降低，而储存在脂滴中的脂质——三酰甘油——的水平显著增加。对公开转录组数据的分析表明，LPS激活小胶质细胞导致脂质生物合成过程的上调，特别是脂肪酸合成和脂肪酸穿梭进入三酰甘油的过程。研究人员汇编了一个包含²⁷⁸个参与膜和储存脂质代谢的基因列表，并分析了它们在LPS刺激以及其他数据集（Aβ刺激iPSC来源的小胶质细胞、LPS刺激小鼠小胶质细胞）中的表达模式。他们观察到三酰甘油生物合成中多种酶的上调，包括前体二酰甘油的生成（GPAT4， AGPAT2，4）、脂肪酸的合成（FASN）及其活化（ACSL1，3，4），以及由二酰甘油酰基转移酶2（DGAT2）催化的三酰甘油合成的最后步骤。相反，与脂肪酸分解代谢相关的途径，包括溶酶体和线粒体利用途径，则被下调。激活的小胶质细胞还增加了基因ESYT2、C2CD2L和ANO8的表达，这些基因调控质膜与内质网（脂滴合成位点）之间的接触位点。这些变化可能有助于在细胞受刺激时将脂肪酸从膜脂质中移出，以储存在三酰甘油中。对抑制脂滴形成（通过药理学抑制三酰甘油合成酶DGAT1和DGAT2）影响转录本数据的分析发现，在LPS刺激的细胞中，脂滴合成抑制影响了与趋化性、细胞迁移、吞噬作用、膜脂分解代谢和膜结构形态发生相关的转录本类别。在未刺激的细胞中，DGAT抑制引起了肌动蛋白重塑基因（ARHGAP/ARGEF， RAC2）、趋化性相关基因（CCLs， CCRs， CMKLR1， CNR2， GPR84， ADGRE1/2/3， FPR3）以及导向线索信号基因（semaphorin基因， SLIT3）的变化。此外，研究人员比较了人iPSC来源小胶质细胞经LPS刺激后LDAM基因集中人类同源物的表达与衰老小鼠大脑中的表达，发现有¹⁸⁴个转录本在这两个数据集中呈相同方向的显著变化。这些基因的富集分析鉴定出多个GTP酶活性、细胞迁移和细胞骨架重塑的调节因子。这些发现共同证明了在激活期间基因表达向利用磷脂和脂肪酸前体进行三酰甘油生物合成的转变。研究人员认为，这些改变指示了在细胞迁移和质膜面积减少期间发生的脂滴合成。

**讨论与结论**
在静息、稳态条件下，小胶质细胞具有许多精细突起的复杂形态，监测大脑微环境中的损伤迹象。小胶质细胞在响应损伤时迅速改变形状，例如响应激光消融细胞、ATP和Aβ。随着年龄增长和APOE4基因型，这些反应会减慢。突起向损伤部位的投射伴随着远离损伤部位的突起的缩回。这些变化与质膜从小胶质细胞的一个区域快速重新分布到另一个区域相一致。在更长的时间内，小胶质细胞经历剧烈的形态变化，呈现出分支更少、更粗的突起或更简单、更圆润的形状。在AD大脑中，聚集在淀粉样斑块附近的小胶质细胞采用阿米巴样形状，并显示稳态基因表达降低。在5XFAD淀粉样蛋白脑模型中，靠近斑块的小胶质细胞具有更大的阿米巴样形态，而远离斑块的小胶质细胞具有更延伸的突起。含有脂滴的小胶质细胞在淀粉样斑块¹⁰微米内的区域富集，脂滴负荷随着与斑块距离的增加而减少；这些发现在人脑切片中得到证实。

小胶质细胞形状随刺激和激活而发生的这些变化必然涉及质膜的大量重塑。这种脂质双分子层可以在急性突起运动期间快速重新分布，或在慢性形状变化期间更广泛地重新定位。激活的小胶质细胞脂滴增加，在慢性范例如5XFAD淀粉样蛋白小鼠模型中也存在脂滴。研究人员对5XFAD大脑的研究发现，与远离斑块的小胶质细胞相比，淀粉样斑块附近的小胶质细胞具有更小的表面积。他们提出，脂滴形成提供了一种动态机制，用于储存因表面积减少而从质膜移除的多余脂质。这些脂滴在慢性激活（如淀粉样斑块周围）下可能保持高水平，以允许小胶质细胞突起移除、延伸和恢复的灵活性。

对现有数据集的分析表明，激活的小胶质细胞上调了对三酰甘油合成重要的基因，包括限速酶DGAT2、产生前体的酶（AGPATs， GPATs）以及参与脂肪酸生成和酰化的酶（FASN， ACSLs）。为了确定LPS刺激的iPSC来源小胶质细胞中的这些脂质基因变化是否在其他情境中重现，研究人员分析了另外两个数据集：一个是iPSC来源小胶质细胞用Aβ处理，另一个是表达人APOE3或APOE4等位基因的小鼠用LPS处理。在这两种情况下，都观察到脂肪酸酰化酶（ACSL1–4）、三酰甘油前体（AGPAT4， PLC）和脂滴相关蛋白（PLIN3）的表达增加。用Aβ激活小鼠小胶质细胞减少了质膜脂质物种（磷脂酰胆碱和鞘磷脂），同时增加了三酰甘油。这些发现表明，在人和小鼠细胞与组织中存在与小胶质细胞激活相关的向脂质储存的代谢重编程。这些变化与APOE4、衰老和患病小胶质细胞中脂滴积累增加的报道一致。

研究人员还注意到参与脂质降解的线粒体和溶酶体途径的下调，这表明小胶质细胞脂滴可能主要不是用于能量生产。他们认为，脂滴可能部分充当多余膜脂质的储存库，可供后续动员。支持这一结论的是，他们发现磷脂酶（PNPLA6， PLC）和膜重塑基因（ARF1， VMP1）的表达增加，这与中性脂质积累同时发生的活跃质膜重组一致。来自衰老小鼠以及iPSC来源小胶质细胞的超微结构电子显微镜图像显示质膜和膜衍生的内溶酶体区室与脂滴的接近性。研究人员还发现与质膜和内质网之间接触位点相关的转录本上调，这表明脂滴的生物发生可能涉及表面和内部的质膜。

除了细胞内脂质储存增加外，膜重塑过程中多余的原膜脂质也可以通过脂质外流过程从小胶质细胞释放。脂质外流需要脂质转运蛋白如ABCG1和ABCA1，以及载脂蛋白受体如apoE或apoJ。apoE4蛋白在脂质外流方面比apoE3或apoE2效率低，这可能会限制在激活条件下从小胶质细胞中移除多余脂质。这种缺陷可能有助于解释APOE4细胞中更高的脂滴积累。或者，膜脂质可以通过外泌体释放，这是一个在巨噬细胞中由嘌呤能受体P2X7R激活促进的过程。磷脂内化和外流的伴随激活可以允许在质膜减少期间对内膜和外膜小叶进行必要的重组。

转录组分析已经鉴定出许多类别的小胶质细胞，并对其功能进行了推测。其中几类似乎是稳态性质的，具有高水平的P2RY12（本研究中介导部分急性小胶质细胞形状变化的受体）。在各种神经退行性疾病中存在几类小胶质细胞。研究人员的模型表明，富含脂滴的小胶质细胞是由于先前响应激活刺激（如小鼠和人类中的淀粉样蛋白）的膜重组而形成的。

检验这些假说可以侧重于确定小胶质细胞膜变化与脂滴积累之间的因果关系。一种方法可以利用条件性、小胶质细胞特异性敲除此处描述的三酰甘油合成途径相关基因（例如，DGAT， PLC）。另一种方法可以探索促进脂质外流对淀粉样斑块附近脂滴丰度的影响。此外，使用荧光可追踪脂质前体的体外测定可以直接观察激活诱导的脂质再分布是否发生在膜和脂滴之间。

关于脂滴在许多细胞类型中的作用存在推测，包括作为能源、吞噬后脂质碎片或质膜的收集器，以及向其他细胞输送脂质的来源。本研究的结果也将脂滴形成定位为小胶质细胞膜重塑的结果，当细胞表面积减少形成更多阿米巴样形状时发生。通过将质膜脂质的快速重新分布与长期隔离联系起来，小胶质细胞可以适应急性和慢性刺激。这种平衡的破坏，如在衰老、APOE4基因型和神经退行性疾病中所见，可能会损害对小胶质细胞功能至关重要的细胞可塑性。因此，调节脂质动员和储存可能为调节小胶质细胞功能提供新的途径。