《Journal of Proteome Research》：Maximizing Lipidome Coverage of Mouse Liver Following the IV Administration of Gefitinib by Combining Both UHPLC-MS-Based Untargeted and Targeted Lipidomics
编辑推荐：
研究人员对给予酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)吉非替尼(Gefitinib, 10 mg/kg, 静脉注射 intravenous, IV)后的小鼠肝脏提取物分别进行了非靶向"发现性(discovery)"脂质分
研究人员对给予酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)吉非替尼(Gefitinib, 10 mg/kg, 静脉注射 intravenous, IV)后的小鼠肝脏提取物分别进行了非靶向"发现性(discovery)"脂质分析和靶向脂质分析，以最大化肝脏脂质组的覆盖度。采用反相超高效液相色谱-离子淌度-质谱(reversed-phase ultra-high-performance liquid chromatography-ion mobility-mass spectrometry, RP-UHPLC-IM-MS)在正(+ve)、负(-ve)电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)模式下进行非靶向脂质分析，结果显示脂质谱存在时间相关性变化，包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines, PCs)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines, PEs)丰度降低，伴随溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholines, LPCs)升高。采用亲水相互作用液相色谱-超高效液相色谱-质谱(hydrophilic interaction liquid chromatography-UHPLC-MS, HILIC-UHPLC-MS)于+ve ESI下进行靶向分析，同样显示吉非替尼给药小鼠脂质谱存在时间依赖性影响，涉及PCs、鞘磷脂(sphingomyelins, SMs)、甘油三酯(triglycerides, TGs)及LPCs，尤以脂质PC(34:1)、PC(32:1)、SM(40:1)、TG(48:1)及PC(32:0)显著，且多种酰基肉碱(acyl carnitines, CARs)也受到影响。此外，-ve ESI模式下亦观察到对一系列脂质的时间相关影响，包括磷脂酰甘油(phosphatidylglycerols, PGs)、PCs、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamines, LPEs)、PEs及游离脂肪酸(free fatty acids, FFAs)。所得数据提示，暴露于吉非替尼可能导致小鼠肝脏中脂肪酸利用及代谢发生广泛影响。
论文解读：吉非替尼静脉给药后小鼠肝脏脂质组学的非靶向与靶向联合分析
本研究发表于《Journal of Proteome Research》。吉非替尼（Gefitinib）是一种靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI），既往研究发现其可引发生物样本代谢组和脂质组的变化且与血药浓度相关，但这些变化可提示药效生物标志物、作用机制（mode of action, MOA）及脱靶毒性。肝脏是脂质生物合成的主要器官，为全面解析吉非替尼对肝脂质代谢的影响并最大化脂质组覆盖率，研究人员在已开展血浆脂质组研究基础上，选取经IV给予吉非替尼（10 mg/kg）的雄性C57Bl/6JRj小鼠不同时间点（0.5、1、3、8、24 h）获取的肝脏组织，联合采用非靶向发现性RP-UHPLC-IM-MS（±ESI）与定量靶向HILIC-MS/MS（±ESI）两种互补脂质组学策略进行分析，探讨吉非替尼暴露对小鼠肝脏脂质组的药效脂质动力学（pharmacolipidodynamic）影响。
主要关键技术方法
研究人员取雄性C57Bl/6JRj小鼠经IV给予吉非替尼（10 mg/kg）后，于0.5、1、3、8、24 h处死取肝（n=2/时间点），以空白CD1小鼠肝为基质。肝组织经改良Bligh-Dyer法（二氯甲烷:甲醇=3:1提取，加甲醇:水相分离）萃取脂质，加入稳定同位素标记（stable isotope-labeled, SIL）内标（SPLASH LIPIDOMIX等）。非靶向分析采用RP-UHPLC-IM-MS（Waters ACQUITY Premier CSH C18柱，Synapt XS离子淌度质谱，±ESI，质荷比m/z 50–1200，碰撞截面collision cross section, CCS校准），数据经Lipostar软件峰识别、对齐及归一化（sum of areas法），多元统计采用PCA与PLS-DA（MetaboAnalyst）。靶向分析采用HILIC-UHPLC-MS/MS（Waters ACQUITY Premier BEH Amide柱，Xevo TQ-XS三重四极杆，多反应监测multiple reaction monitoring, MRM模式，±ESI），以Odd-Chain LIPIDOMIX建立标准曲线，TargetLynx XS与Skyline定量，同样进行PCA与PLS-DA分析。质控（QC）样本为混合研究样本及空白基质，穿插于进样序列中监控系统漂移。
Results and Discussion
Discovery Untargeted RP-UHPLC-IM-MS-Based Lipidomics of Liver Extracts
非靶向RP-UHPLC-IM-MS在+ve与-ve ESI下分别检出1544和1562个特征（CV<30%），经质谱误差（<5 ppm前体，<10 ppm碎片）、碎片离子及同位素相似性质控，最终高置信鉴定为215个（+ve ESI）和184个（-ve ESI）脂质特征，合并去重后共303种脂质（96种为两模式共有）。排除吉非替尼及其代谢物（M3、M6）相关信号后，PLS-DA显示各采血时间点呈明显时间轨迹分布。+ve ESI模式VIP（variable importance in projection）前25位含PCs、TGs、SM、PE、DGs、PA；-ve ESI模式含神经酰胺（ceramides, Cers）、PEs、PCs等。PC类（如PC(34:1)）给药后相对丰度下降，3 h最低，24 h回升；LPCs则相反，给药后升高并于3–8 h达峰，显示PC与LPC呈反向变化关系，提示吉非替尼可能影响磷脂酶A2（phospholipase A2, PLA2）及Land循环介导的PC→LPC转化。
Gefitinib and Related Metabolites
靶向HILIC-MS/MS半定量显示吉非替尼肝浓度0.5 h达峰（~15,000 ng/mL，约300 ng/mg组织），随后递减，8 h约3500 ng/mL，24 h约90 ng/mL，与血浆浓度变化趋势相符。O-去甲吉非替尼（M523595）仅在0.5和1 h可检但未达定量下限；M3随药物消退，M6在3 h达峰。
Quantitative Targeted Lipid Analysis
靶向HILIC-MS/MS监测433个分析物（含PCs、SMs、TGs、LPCs、PEs、PGs、LPEs、FFAs及CARs等），校准曲线线性良好（5 ng/mL–84,750 ng/mL），内标CV多<15%。+ve ESI PLS-DA显示时间点分离，VIP前位为PC(34:1)、PC(32:1)、SM(d40:1)、TG(50:1)、LPC(18:1)；-ve ESI VIP含游离脂肪酸（free fatty acids, FFAs）、PGs、PCs、LPEs、PEs。定量数据证实PCs（如PC(34:1)、PC(34:2)）先略降后于3 h升至峰值再回落；TGs（TG(50:1)、TG(50:3)）0.5 h后下降，1 h最低，3 h回升后再降。含C16:0（棕榈酸）残基的脂质占变化最显著脂质的近半数，提示新生脂生成（de novo lipogenesis, DNL）及脂肪酸合酶（fatty acid synthase, FASN）途径可能参与。LPC(18:1)在给药组显著升高，SM(d36:1)、葡萄糖神经酰胺GlcCer(34:1)及CAR(18:2)（亚油酰-L-肉碱）相对降低。
Targeted Analysis of Free Fatty Acids (FFA)
-ve ESI HILIC-MS/MS显示FFAs受吉非替尼影响：FA(16:0)、FA(16:1)、FA(18:0)、FA(18:1)、FA(20:4)在0.5 h后下降，1 h最低，3–8 h回升，24 h再降；FA(18:2)、FA(22:6)从0.5 h渐升至8 h后略降；FA(22:5)较稳定。
Targeted Analysis of Liver Acyl Carnitines (CAR)
酰基肉碱中，CAR(4:0)先降后升（8 h最低，24 h回升），CAR(8:0)、CAR(14:0)、CAR(18:0)、CAR(18:1)呈先降（0.5→1 h最低），8 h回升，24 h再降；CAR(16:0)持续降低至24 h略有恢复。长链酰基肉碱的变化可能与线粒体脂肪酸β-氧化转运及应激、炎症通路激活相关。
讨论与结论总结（翻译结论部分）
联合对同一标本进行非靶向与靶向脂质组学表征，可更全面地评估小鼠肝脏脂质组的变化。采用RP-UHPLC-IM-MS的非靶向脂质分析揭示了吉非替尼静脉给药后PCs和PEs减少及LPCs增加的可能现象。采用HILIC-MS的靶向分析显示了吉非替尼对PCs、SMs、TGs、LPCs、FFAs、PGs、LPEs、PEs及酰基肉碱谱的时间相关性影响。尽管本研究存在动物数有限及采样点较少的局限，这些测量结果似可揭示EGFR抑制剂吉非替尼对肝脏脂质谱存在复杂的时间依赖性、药物相关（药效脂质动力学）影响。若经进一步研究证实，上述发现可增进对TKI抑制效应之全面了解，并揭示此类重要药物的作用方式。
