不同炮制天麻(Gastrodia elata Bl.)来源类细胞外囊泡样颗粒的比较分析：理化性质、生物安全性及作为功能性食品原料的神经保护潜力

《Food Science & Nutrition》：Comparative Analysis of Extracellular Vesicle-Like Particles From Different Processing Gastrodia elata Bl.: Physicochemical Properties, Biosafety, and Neuroprotection Potential as a Functional Food Ingredient

　　

摘要 天麻(Gastrodia elata，GE)是经典的药食同源植物，长期用于膳食实践中发挥抗炎、神经保护及改善脑血管循环的作用。近年来，可食用植物来源的类细胞外囊泡样颗粒(extracellular vesicle-like particles, EVLPs)作为一类新型膳食活性成分及天然纳米载体备受关注，在健康相关领域展现出广阔应用前景。然而，食品加工技术如何影响此类EVLPs的特征尚不清楚。为此，本研究旨在从三种炮制品——干制天麻(dried GE, DGE)、酒制天麻(wine-processed GE, WGE)及姜制天麻(ginger-processed GE, GGE)中分离EVLPs，并系统评价其理化性质、生物安全性及在神经健康方面的潜在功能。研究人员表征了三种天麻源EVLPs(GE-EVLPs)的形貌、粒径、浓度及ζ电位(zeta potential)，采用非靶向代谢组学(non-targeted metabolomics)分析其生物活性分子组成，通过细胞毒性实验、溶血试验及组织病理学检查全面评估生物安全性，并在氧糖剥夺/复氧(oxygen–glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)细胞模型中进一步评估其对神经细胞活力及免疫调节功能的影响以探讨其支持神经健康的潜力。研究结果表明，三种炮制品中均存在EVLPs，且炮制方式显著影响其物理性质、功能成分及促健康功效。值得注意的是，WGE-EVLPs因具有较小粒径、更优的细胞摄取效率及增强的保护效应而表现出最大的开发潜力。本研究为食品加工如何调控可食用植物源EVLPs的功能特性提供了新见解，并凸显了其作为支持神经健康的功能性食品配料或膳食纳米载体的应用前景。

《Food Science & Nutrition》刊登的此项研究针对药食同源植物天麻(Gastrodia elata Bl.)不同炮制品中类细胞外囊泡样颗粒(extracellular vesicle-like particles, EVLPs)的存在性、特征差异及功能开展系统探究。目前可食用植物源EVLPs作为新型膳食活性成分和天然纳米载体受到广泛关注，但食品加工（如中药炮制）对其存在、含量及生物活性的影响尚不明确。天麻传统上有干制(DGE)、酒制(WGE)、姜制(GGE)等炮制方式，可改变化学成分与功效，但炮制是否及如何影响其中EVLPs的特性与神经保护功能尚无报道。研究人员以新鲜天麻根茎经标准化炮制获得DGE、WGE、GGE，从中分离纯化对应EVLPs(DGE-EVLPs、WGE-EVLPs、GGE-EVLPs)，系统比较其理化表征、活性成分谱、体外与体内生物相容性、BV2小胶质细胞的摄取与增殖作用，以及在OGD/R损伤模型中的神经保护效应与微胶质细胞极化调节作用，证实炮制方式显著影响GE-EVLPs特性，其中酒制天麻源EVLPs综合表现最优，具作为功能性食品纳米成分的开发潜力。

研究人员开展本研究用到以下几个主要关键的技术方法：样本为陕西产新鲜天麻根茎经标准炮制(100℃蒸60 min切片60℃烘干制得DGE；DGE加姜汁10:1 w/v浸润后文火炒干制得GGE；DGE加米酒5:1 w/v浸润后文火炒干制得WGE)。EVLPs提取采用匀浆—梯度离心(3000×g 10 min、6000×g 20 min、10000×g 30 min，4℃)—0.45 μm及0.22 μm滤膜过滤—Exodus全自动外泌体提取系统纯化。物理表征使用透射电子显微镜(TEM)观察形态，纳米颗粒追踪分析(NTA)测粒径与颗粒浓度，电位分析仪测ζ电位；蛋白定量用BCA法；活性小分子成分分析联合UPLC?MS非靶向代谢组学与HPLC?DAD检测天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛及 parishins A/B/C/E；网络药理学预测WGE?EVLPs成分类靶点并与缺血性脑卒中疾病靶点取交集做PPI与KEGG/GO富集，部分配体?受体做分子对接(AutoDock Vina)；细胞实验使用小鼠小胶质BV2细胞系，CCK?8测细胞毒性与增殖，PKH67荧光标记结合流式细胞术与高内涵成像系统分析细胞摄取；OGD/R模型(无糖DMEM、1% O₂/5% CO₂/94% N₂缺氧9 h后常氧复氧6 h)检测EVLPs预处理对细胞活力的保护，免疫荧光染CD86(M1标记)与CD206(M2标记)及RT?qPCR检测极化相关基因；体外溶血试验用2%红细胞悬液测溶血率(ISO 10993?5判定<5%合格)；体内生物相容性用SD大鼠连续14天灌胃GE?EVLPs后取心肝肾脾肺做H&E染色组织病理学检查；数据统计用One?way ANOVA及Tukey/Dunnett检验(p<0.05为显著差异)。

3 Results（结果）

3.1 Physical Characterization of DGE-EVLPs, WGE-EVLPs, and GGE-EVLPs

TEM显示三种GE?EVLPs均呈典型杯状形态、结构完整；NTA测得颗粒浓度分别为2.3×10¹¹、1.2×10¹¹、3.6×10¹¹particles/mL，平均粒径分别为197.7 nm、158.3 nm、188.8 nm，WGE?EVLPs粒径显著小于DGE?EVLPs与GGE?EVLPs(p<0.05)；ζ电位分别为?12.62±1.23 mV、?13.53±0.31 mV、?11.74±0.29 mV，WGE?EVLPs绝对值最高(p<0.05)，胶体稳定性更好；模拟胃肠液处理下三种EVLPs均保持纳米尺度分布，无明显聚集或崩解。结论：三种炮制品均含EVLPs，酒制使EVLPs粒径更小、表面电荷更稳定，利于细胞摄取与体内循环。

3.2 Compositional Analysis of DGE-EVLPs, WGE-EVLPs, and GGE-EVLPs

UPLC?MS非靶向代谢组学鉴定到三者共有2146个代谢物，主要类别含香豆素及苯丙素类、萜类、脂肪酸、生物碱；PCA显示WGE?EVLPs代谢谱与另两组明显区分。HPLC检测显示三种EVLPs均含天麻素(gastrodin)、对羟基苯甲醇(4?Hydroxybenzyl alcohol)、parishins A/B/C/E六种特征成分，对羟基苯甲醛仅痕量见于DGE?EVLPs；WGE?EVLPs中Perilloside C、对羟基苯甲醇、白藜芦醇(resveratrol)、天麻素及Parishin A相对丰度高于另两组。网络药理学获250个GE?EVLPs与缺血性脑卒中共同靶点，PPI提示STAT3、SRC、JUN、TP53、AKT1、MAPK1为核心枢纽；KEGG富集于神经活性配体?受体互作等通路；分子对接显示Viscidulin I等与MAPK3、PTGS2、MMP9结合能≤?9.0 kcal/mol。蛋白浓度BCA测定DGE/WGE/GGE?EVLPs分别为4.8、11.0、6.2 μg/μL，颗粒/蛋白比在同一数量级。结论：炮制改变EVLPs负载活性小分子谱，WGE?EVLPs富含多种具神经保护潜力的代谢物并具多组分?多靶点协同作用特征。

3.3 Biocompatibility Evaluation

溶血试验各浓度组(200–1000 μg/mL)溶血率均<5%(WGE?EVLPs最高浓度时为1.81%)，符合ISO 10993?5标准，无非溶血毒性。SD大鼠连续14天灌胃给药后主要脏器H&E染色未见病理损伤，组织结构正常。结论：三种GE?EVLPs在测试剂量下血液相容性与体内短期生物相容性良好，满足食品级纳米材料安全要求。

3.4 Cellular Uptake of DGE-EVLPs, WGE-EVLPs, and GGE-EVLPs by BV2 Cells

PKH67标记流式细胞术示BV2细胞对DGE/WGE/GGE?EVLPs摄取阳性率分别为74.7%、82.0%、73.1%，WGE?EVLPs摄取效率显著高于其余两组(p<0.05)；高内涵成像见绿色荧光分布于核周，游离染料对照无信号，证实EVLPs以完整囊泡被细胞内化。CCK?8显示5–320 μg/mL范围内均无细胞毒性，且促进BV2增殖，160 μg/mL时WGE?EVLPs组相对增殖率达203.33%，显著高于DGE?EVLPs(143.90%)与GGE?EVLPs(109%)(p<0.05)。结论：GE?EVLPs可被小胶质细胞高效内化且无毒性，WGE?EVLPs因较小粒径具最佳摄取与促细胞活力效果。

3.5 Protective Benefits of DGE-EVLPs, WGE-EVLPs, and GGE-EVLPs in BV2 Cells Subjected to OGD/R

OGD/R模型细胞活力降至约66.00%，预加160 μg/mL DGE/WGE/GGE?EVLPs分别使活力提升10.21%(p<0.05)、19.15%(p<0.001)、3.67%(ns)，WGE?EVLPs自20 μg/mL即显保护作用(p<0.05)，160 μg/mL时活力恢复至85.15%。免疫荧光与RT?qPCR显示OGD/R上调M1标记CD86，三种EVLPs处理后CD86表达下调、M2标记CD206表达上调，WGE?EVLPs(160 μg/mL)促M2极化最显著(p<0.001)。结论：GE?EVLPs可抑制过度M1活化、促进M2型极化以调节神经炎症微环境，WGE?EVLPs对OGD/R诱导的小胶质细胞损伤具最强神经保护潜能。

讨论与结论总结（Discussion & Conclusion）

讨论指出本研究首次证实三种炮制品天麻中含EVLPs，炮制方式(尤其是酒制)可通过改变粒径、ζ电位及负载活性小分子谱影响功能表现；WGE?EVLPs因较小粒径(158.3 nm)、较高负ζ电位、更优细胞摄取效率及富含天麻素、Parishin A等神经活性代谢物，在OGD/R模型中展现最强细胞保护及促M2极化作用；GE?EVLPs纳米脂质双层可保护活性成分并作为食品级天然递送平台。研究局限性包括未完全排除辅料(酒/姜汁)自身囊泡或可溶性成分贡献、自全组织匀浆而非质外体洗脱液分离故亚细胞来源未定、仅在细胞模型与亚急性经口毒理评估需后续体内缺血模型与药代验证、特定 cargo与效应间为相关性需 cargo敲减/回补实验确证。

结论(Conclusion)：三种炮制品来源GE?EVLPs均具优良血液相容性与生物安全性，符合食品级纳米材料要求；炮制显著影响EVLPs理化性质与活性成分，酒制天麻EVLPs具最小粒径、最佳细胞摄取及最强OGD/R保护效应，具作为支持神经健康的功能性食品配料开发潜力，为药食同源植物深加工及可食用植物EVLPs资源化利用提供科学依据。