散发性肌萎缩侧索硬化症患者与其他神经系统疾病患者脑脊液蛋白质组学分析比较

《Journal of Neurochemistry》：Comparison of Proteomic Analysis of Cerebrospinal Fluid From Neurological Patients With and Without Amyotrophic Lateral Sclerosis

　　

摘要：肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种神经退行性疾病，以延髓和四肢肌肉进行性无力为特征，导致具有运动和非运动症状的多样化临床表型。约85%的ALS病例为散发性（sporadic ALS，sALS），其余10%–15%为家族性（familial ALS，fALS）。散发性ALS的生物学生物标志物仍知之甚少，阻碍了精确的患者筛查、延误诊断并对预后产生负面影响。本研究旨在通过比较sALS患者与其他神经系统疾病患者脑脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）的蛋白质组学特征，鉴定潜在的蛋白质生物标志物。采用液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS）对24例sALS患者和26例其他神经系统疾病患者的CSF样本进行蛋白质组学分析。使用双尾Student's t检验比较完整蛋白质表达谱，以p < 0.05为统计学显著阈值，并附加错误发现率（False discovery rate，FDR）校正（FDR < 0.1）。CSF蛋白质组学分析鉴定出sALS与非ALS患者间96个蛋白质存在定量显著差异（p < 0.05），其中74个蛋白质经FDR校正后仍显著（FDR < 0.1），包括与神经退行性过程相关的蛋白质改变，如淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）和炎症标志物。CSF蛋白质组学分析揭示了炎症和神经退行代谢通路的改变，为sALS的蛋白质组学景观提供了有价值的见解。若干失调蛋白质与既往研究强调的疾病机制一致。这些发现为推动sALS个性化诊断和管理方法的开发迈出了一步。

论文解读：散发性肌萎缩侧索硬化症患者与其他神经系统疾病患者脑脊液蛋白质组学分析比较

该研究发表于《Journal of Neurochemistry》。肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种进行性神经退行性疾病，以运动神经元丢失致延髓及肢体肌无力萎缩为特征，约85%为散发性（sporadic ALS，sALS）。目前sALS缺乏特异性生物学生物标志物，导致早期诊断困难、预后评估受限。已有研究提示CSF蛋白质组学可揭示ALS相关分子改变，但sALS特异性的CSF蛋白谱仍需进一步探索。为此，研究人员采集sALS患者及其他神经系统疾病（非ALS）患者的CSF标本，采用无标记定量蛋白质组学方法筛选差异表达蛋白并进行通路富集分析，旨在阐明sALS的CSF分子特征及潜在生物标志物。

主要关键技术方法：

研究人员收集爱沙尼亚塔尔图大学神经科2013–2018年50例患者的CSF样本，包括24例经El Escorial标准确诊且无家族史的sALS患者（ALS组）和26例其他神经系统疾病患者（非ALS对照组，含非特异性白质病变、脑卒中、可疑CNS感染等）。CSF经0.22 μm过滤后使用人Multiple Affinity Removal System（MARS Hu?14）去除高丰度蛋白，胰蛋白酶/Lys?C混合酶解，C18除盐后，采用纳升液相色谱?串联轨道阱质谱（nano LC?MS/MS，Q Exactive Plus）进行数据依赖采集（Data?dependent acquisition，DDA）分析。原始数据用MaxQuant（含Andromeda搜索引擎）比对UniProt人源数据库进行定性定量，采用无标记定量（Label?free quantification，LFQ），两组间差异用双尾Student's t检验并做Benjamini?Hochberg法FDR校正（FDR < 0.1）。差异蛋白分别用ReactomePA（Reactome通路）、clusterProfiler（KEGG通路）及DOSE（疾病本体Disease Ontology）进行功能富集分析。

3 Results（结果）

3.1 Proteome Overview and Differential Expression Analysis（蛋白质组概览与差异表达分析）：

从50例CSF样本中鉴定到1223个非冗余蛋白质。按≤20%缺失值过滤得348个可靠定量蛋白，其中94个在p < 0.05水平差异表达，74个FDR < 0.1（59个上调、15个下调）；严格限定无缺失值得186个蛋白，58个p < 0.05差异，48个FDR < 0.1（39个上调、9个下调）。上调蛋白Fold change为1.12–1.66，下调为0.42–0.83。结果表明sALS CSF存在可重复的主导上调蛋白特征。

3.2 Functional Enrichment and Pathway?Level Organisation of the CSF Proteome（CSF蛋白质组功能富集与通路水平组织）：

ReactomePA鉴定47条显著富集通路（FDR < 0.05），最显著为补体级联调节（Regulation of Complement cascade）和补体级联（Complement cascade）；KEGG鉴定11条显著通路（FDR < 0.05），首位为补体与凝血级联（Complement and coagulation cascades hsa04610）及内质网蛋白加工（Protein processing in endoplasmic reticulum hsa04141）；DOSE分析显示阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）、Tauopathy等神经退行性疾病本体显著富集。上调蛋白包括C1q（A/B/C亚基）、C1r、C1s、C2、C4a及补体调节蛋白CD59，内质网应激分子BiP（HSPA5/GRP78）、钙网蛋白（Calreticulin），淀粉样前体蛋白（APP）及其类似物APLP1、APLP2，载脂蛋白A?IV（APOA4），透明质酸结合蛋白2（HABP2/FSAP），凝血酶原（Prothrombin），胶质细胞源性神经营养因子受体α2（GFRA2），Desert hedgehog受体DNER，以及多个钙黏蛋白家族成员Cadherin?2（CDH2）、Cadherin?13（CDH13）、Cadherin?15（CDH15）和Protocadherin?1（PCDH1）。结论为sALS CSF中补体?免疫、内质网应激、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）重塑及凝血?纤溶相关通路协同失调。

3.3 Statistical Workflow and Curation（统计流程与注释整理）：

说明差异蛋白列表经Fold change和FDR筛选后，分别映射至Reactome（2848条通路）、KEGG（314条人源通路）及Disease Ontology（≈11000个疾病词条），采用超几何检验及Benjamini?Hochberg FDR校正进行过代表分析，背景集为研究中检测到的全部蛋白。

4 Discussion（讨论）

研究人员提出ALS应被视为神经血管?神经肌肉单元（Neurovascular?neuromuscular unit）功能障碍的系统性疾病：早期神经血管单元（Neurovascular unit，NVU）功能异常致血?脊髓屏障完整性受损、慢性先天免疫激活（补体级联持续活化而非单纯炎症增高），伴随ECM?钙黏蛋白重塑削弱运动神经元及神经?肌肉接头稳定性，继而引起代谢支持不足诱发内质网未折叠蛋白反应（Unfolded protein response，UPR）及蛋白稳态崩溃。同时CSF中存在Clusterin（分泌型分子伴侣）、Secretogranin?2（SCG2）等代偿性神经保护/修复信号，提示内源性保护尝试但最终不足以逆转病程。研究结果与近期ALS CSF蛋白质组学报道（如Trautwig et al. 2025）互补级联活化及ER应激结论一致，并新发现协调的钙黏蛋白家族上调及HABP2?凝血?纤溶信号，拓展了ALS神经血管?ECM参与的认识。局限性包括样本量偏小、使用神经疾病对照引入异质性、CSF低丰度蛋白覆盖有限及仪器深度中等，需独立队列验证候选生物标志物。

综上，研究人员通过对sALS与非ALS神经系统疾病患者CSF的深度蛋白质组比较，鉴定出以补体激活、内质网应激相关分子上调及ECM?钙黏蛋白家族改变为核心的sALS特异性蛋白谱，并富集补体与凝血级联、蛋白加工于内质网及阿尔茨海默病相关本体，为理解sALS发病机制及开发个性化诊断生物标志物提供了蛋白质组学依据。