AI引导优化的恩格列净(Empagliflozin)与西格列汀磷酸一水合物(Sitagliptin Phosphate Monohydrate)复方制剂稳定性指示HPLC方法的建立及绿色分析评价

《Results in Chemistry》：AI-guided optimization and eco-friendly assessment of in lab stability-indicating HPLC method for empagliflozin and sitagliptin in combined pharmaceutical dosage form

　　

摘要：准确的分析方法对于新型抗糖尿病固定剂量复方制剂中恩格列净（Empagliflozin, EMPA）与西格列汀磷酸一水合物（Sitagliptin phosphate monohydrate, SITA）的准确定量与稳定性评价十分必要。人工智能（Artificial Intelligence, AI）在预测色谱条件方面展现出潜力，但实验验证对药物应用具有重要意义。本研究的主要目的是利用AI工具（ChatGPT 4.5 (OpenAI)、Perplexity.ai Sonar (Perplexity AI)）预测并经实验室优化，建立并比较一种用于同时定量EMPA和SITA的稳定性指示高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）方法。实验室采用C18色谱柱，以0.1%三乙胺水溶液（用0.01%正磷酸调节pH至3.5）、甲醇和乙腈按40:35:25 (v/v/v) 为流动相进行色谱条件优化。西格列汀磷酸一水合物与恩格列净的保留时间分别为2.95 min和7.17 min。研究人员按国际人用药品注册技术要求协调会（International Council for Harmonisation, ICH）指导原则对该方法进行验证，并进行了酸、碱、氧化、高温及光解强制降解（Forced Degradation Studies, FDS）试验。采用红绿蓝（Red Green Blue, RGB）模型评估方法绿色度。AI预测方法虽显示相似的色谱条件，但实验实施后峰形较实验室优化方法差且分离度较低。所建立的实验室HPLC方法经验证合格，绿色性评价显示该方法具备绿色属性。本方法检出限（Limit of Detection, LOD）/定量限（Limit of Quantitation, LOQ）低于已发表文献方法。据研究人员所知，这是首项通过AI工具预测EMPA与SITA同步测定色谱条件并将其实验性能与实验室优化方法直接对比的研究。所提出的方法简便、灵敏、耐用，适用于常规质量控制分析。

论文解读：恩格列净与西格列汀复方制剂AI辅助优化稳定性指示HPLC方法的建立及绿色评价

研究背景与意义

恩格列净（Empagliflozin, EMPA，SGLT2抑制剂）与西格列汀磷酸一水合物（Sitagliptin phosphate monohydrate, SITA，DPP-4抑制剂）组成的固定剂量复方制剂（Fixed-Dose Combination, FDC）于2024年9月获印度中央药品标准控制组织（CDSCO）批准用于2型糖尿病治疗。现有文献多为紫外分光光度法或普通HPLC法，缺乏能检测应激条件下降解产物的稳定性指示方法（Stability-Indicating Method, SIM），且未见针对该复方采用光电二极管阵列检测器（Photodiode Array Detector, PDA）的同时测定报道，亦无绿色分析化学（Green Analytical Chemistry, GAC）工具评估。人工智能（Artificial Intelligence, AI）工具可辅助预测色谱条件但需实验确证。因此，研究人员开展了首个结合AI预测与实验室优化、针对EMPA-SITA复方制剂的SIM-HPLC方法开发、验证、强制降解考察及多维度绿色度评价研究，论文发表于《Results in Chemistry》。

主要关键技术方法

研究人员以Zydus公司市售EMPAGLYN-S 10/100片剂及EMPA、SITA原料药为对象，使用Shim-pack C₁₈柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm），PDA检测器，对比ChatGPT 4.5与Perplexity.ai Sonar预测的色谱条件与实验室优化等度洗脱条件之差异。按ICH Q2(R2)指南进行系统适用性、线性、准确度（加标回收）、精密度（重复性及日内/日间）、耐用性验证；按ICH指导原则进行酸、碱、氧化（3% H₂O₂）、热（80℃）、光解（UV 6 h）强制降解研究（Forced Degradation Studies, FDS）并借PDA评估峰纯度；采用分析生态标尺（Analytical Eco-Scale）、分析绿色度度量（Analytical GREEnness Metric, AGREE）、蓝色适用性等级指数（Blue Applicability Grade Index, BAGI）、点击分析化学指数（Click Analytical Chemistry Index, CACI）及白色分析化学（White Analytical Chemistry, WAC）RGB模型综合评价绿色度与实用性。

研究结果

3.1. Optimisation of the HPLC method（HPLC方法的优化）

研究人员经优化确定流动相为0.1%三乙胺（Triethylamine, TEA）水溶液（0.01% H₃PO₄调pH 3.5）:甲醇:乙腈 = 40:35:25 (v/v/v)，流速1.0 mL/min，进样20 μL，柱温30℃，检测波长218 nm。SITA与EMPA保留时间分别为2.95 min和7.17 min，15 min内完成分析，峰形尖锐分离良好。

3.2. Comparison of AI-predicted and laboratory-developed HPLC method（AI预测方法与实验室建立HPLC方法的比较）

将ChatGPT 4.5（推荐20 mM KH₂PO₄缓冲液(pH~3.5):甲醇:乙腈=40:25:35）与Perplexity.ai（推荐0.1% H₃PO₄:甲醇:乙腈=30:30:40）所提条件进行实验测试，结果AI预测条件产生峰展宽、分离度差且首峰接近死时间；实验室优化方法峰形尖锐、分辨率（Resolution, Rs）=15.727、拖尾因子<1.5、理论塔板数>2000。表明AI可作起点但须实验室微调方可得可靠重现结果。

3.3. Validation results（验证结果）

EMPA线性范围2.5–15 μg/mL（r>0.999），SITA为25–150 μg/mL（r=0.998）。EMPA的LOD为0.34 μg/mL、LOQ为1.02 μg/mL；SITA的LOD为1.04 μg/mL、LOQ为3.12 μg/mL，灵敏度优于既往报道。重复性及日内/日间精密度%RSD均<2%。加标回收率EMPA为98.57%–101.04%，SITA为98.13%–101.38%。微小变动流动相比例、pH、流速及检测波长后%RSD<2%，方法耐用。片剂测定回收率为EMPA 98.16%±0.07%、SITA 99.55%±0.52%。

3.4. Forced degradation studies（强制降解研究）

酸碱氧化条件下产生明确降解峰且与原药峰基线分离：酸降解EMPA降12.26%（降解物Rt≈13.80 min），SITA降7.01%（降解物Rt≈4.89, 5.62 min）；碱降解EMPA降17.08%，SITA降13.15%；氧化降解EMPA降10.82%，SITA降13.87%；热与光解条件下无明显新降解峰（EMPA降5.01%–7.88%，SITA降4.23%–6.99%），质量平衡98%–102%。所有主峰峰纯度角小于阈值，证实方法具稳定性指示能力，降解产物不干扰主成分定量。

3.5. Assay of formulation（制剂含量测定）

按上述方法测定市售复方片，EMPA标示量98.16%±0.07%，SITA标示量99.55%±0.52%，证明方法适用于FDC常规检验。

3.6. Greenness and eco-efficiency evaluation of the proposed HPLC method（拟建HPLC方法的绿色度与生态效率评价）

AGREE得分0.54（中等绿色），Analytical Eco-Scale得69分（可接受绿色），BAGI得77.5分（性能与实用性平衡良好），CACI得70分（成本效益佳）。WAC评估中红色（分析卓越）105分、绿色（环境可持续）69分、蓝色（实用可行）100分，综合表现优于文献对照方法。

讨论与结论翻译

研究人员建立了一种灵敏、耐用的HPLC法用于同时定量原料及片剂中恩格列净与西格列汀磷酸一水合物。采用等度洗脱流动相[0.1% TEA水溶液(pH 3.5, 0.01% H₃PO₄校正):甲醇:乙腈 = 40:35:25, v/v/v]，EMPA与SITA保留时间分别为7.17 min和2.95 min，峰对称性与系统适用性良好。方法按ICH Q2(R2)全面验证，特异性、线性、准确度、精密度及耐用性优异。评估了ChatGPT 4.5与Perplexity.ai Sonar预测色谱条件的可行性——AI建议可作方法开发起点，但实验显示保留行为与色谱性能有差异，经后续优化获得更优分离与峰形。多工具绿色度评价显示AGREE 0.54、Eco-Scale 69、BAGI 77.5、CACI 70及WAC综合评分93，表明该方法环境友好且具实操价值。所建方法可靠、环境意识强、操作简便，适用于恩格列净与西格列汀磷酸一水合物的常规分析及稳定性检测。强制降解结果表明制剂应密闭保存，避免潮湿与氧化条件接触，并控制pH以防碱降解。