人类小胶质细胞中的线粒体未折叠蛋白反应破坏神经元—胶质细胞通讯并促进细胞衰老

《Nature Neuroscience》：The mitochondrial unfolded protein response in human microglia disrupts neuronal–glial communication and promotes senescence

　　

线粒体已经演化出一种特化的线粒体未折叠蛋白反应（UPR_mt），用于维持蛋白质稳态并在应激条件下促进恢复。简单生物中的研究表明，胶质细胞中UPR_mt的激活可通过与神经元之间有益的非细胞自主性通讯支持蛋白质稳态。然而，线粒体应激反应在人脑中的作用仍不清楚。为弥补这一空白，研究人员利用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和胶质细胞培养体系，以及脑类器官，研究了线粒体蛋白毒性应激的细胞类型特异性效应。研究显示，线粒体蛋白毒性应激可在人类小胶质细胞中诱导代谢重编程，其特征为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）耗竭和脂质重塑，最终导致衰老表型。通过人源神经元—胶质细胞三元共培养体系以及含小胶质细胞的脑类器官，研究人员鉴定出小胶质细胞在脑衰老及线粒体应激驱动的神经退行性过程中的特异性贡献。UPR_mt激活会破坏小胶质细胞与邻近细胞的通讯，触发炎症信号传导并损害蛋白质稳态。综合而言，这些发现揭示了受损的线粒体蛋白质稳态如何改变细胞间网络，并确定了UPR_mt在神经退行性疾病发病机制中的关键作用。

该研究发表于《Nature Neuroscience》，围绕“线粒体未折叠蛋白反应（UPR_mt）在人脑中究竟发挥保护作用还是致病作用”这一关键问题展开。蛋白质稳态失衡与异常蛋白聚集是衰老和神经退行性疾病的核心病理特征，而线粒体作为维持细胞代谢与蛋白质质量控制的关键细胞器，其内蛋白错误折叠后可激活UPR_mt，诱导分子伴侣和蛋白酶表达，以恢复线粒体稳态。既往在线虫等简单模式生物中的研究提示，胶质细胞可感知线粒体应激，并通过非细胞自主性方式支持神经元稳态；但在哺乳动物尤其是人脑中，这一应答是否同样有益并不明确。与此同时，衰老脑和阿尔茨海默病中与线粒体蛋白稳态有关的LONP1、PITRM1等分子功能下降，提示人脑在年龄增长过程中应对线粒体蛋白毒性应激的能力可能减弱。因此，阐明不同脑细胞类型如何响应UPR_mt、这种反应怎样重塑细胞间通讯，以及其是否推动衰老和神经退行性病变，具有重要理论与疾病学意义。

研究人员建立了多层级人源模型，系统解析线粒体蛋白毒性应激在人脑细胞中的类型特异性作用。研究首先使用人诱导多能干细胞（iPSC）分化获得皮层神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，采用LONP1抑制剂诱导线粒体蛋白错误折叠，并结合PITRM1缺失这一遗传性线粒体蛋白质稳态缺陷模型进行验证。结果表明，尽管神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均可激活UPR_mt，但小胶质细胞表现出最早、最强且最具病理性的应答：其发生显著的线粒体相关错误折叠蛋白积累、代谢重编程、脂滴异常、DNA损伤、炎症因子分泌增加和衰老相关表型。进一步在神经元—星形胶质细胞—小胶质细胞三元共培养体系以及整合小胶质细胞的脑类器官中，研究人员证明，小胶质细胞内源性线粒体蛋白稳态缺陷不仅导致其自身衰老样改变，还会削弱细胞间通讯、损害吞噬与自噬溶酶体功能、促进错误折叠蛋白积累，并伴随神经元完整性下降和淀粉样蛋白沉积增加。总体结论是：UPR_mt在人类小胶质细胞中并非单纯保护性通路，而是可驱动一种与衰老和神经退行性疾病密切相关的致病性状态。

主要技术方法方面，研究人员采用人源iPSC分化的单培养、三元共培养和含小胶质细胞脑组装体（MgBr assembloids）作为核心模型，样本来源包括健康对照iPSC系和PITRM1敲除iPSC系，并辅以Pitrm1^+/?小鼠脑组织进行体内相关性验证。关键技术包括批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、基于CellChat的配体—受体通讯分析、靶向代谢组学与脂质组学质谱分析、免疫荧光与活细胞成像、蛋白聚集检测、自噬通量测定，以及基于核形态学深度学习的衰老评分分析。

在研究结果部分，论文首先在“Pharmacological inhibition of LONP1 differentially induces UPR_mt activation and protein aggregation in human iPSC-derived neurons and glial cells”中指出，LONP1药理学抑制可在三类细胞中诱导UPR_mt，但其时序和后果不同。星形胶质细胞和小胶质细胞在处理后6 h即出现早期UPR_mt激活，而神经元峰值出现在24 h。三类细胞均出现线粒体碎裂和膜电位下降，但仅小胶质细胞发生明显的线粒体相关错误折叠蛋白积累，提示其对线粒体蛋白毒性应激具有特殊脆弱性。

在“LONP1 inhibition elicits divergent stress responses in human iPSC-derived neurons and glia”中，转录组分析显示，各细胞类型普遍激活UPR_mt相关基因及HSF1介导的热休克反应，同时下调多种线粒体编码基因。然而，神经元和星形胶质细胞主要表现为代偿性蛋白质稳态反应，包括分子伴侣上调、内质网未折叠蛋白反应增强、自噬增加和翻译抑制；相反，小胶质细胞在激活UPR_mt的同时上调翻译机器成分，呈现类似整合应激反应（ISR）的适应特征。功能上，星形胶质细胞维持相对稳定，神经元出现氧化应激增强、兴奋性和钙信号下降，而小胶质细胞则转入伴随表观遗传、核结构和炎症通路改变的衰老样失调状态。

在“LONP1 inhibition induces a senescent phenotype in human iPSC-derived microglia”中，研究人员证明线粒体蛋白毒性应激足以在小胶质细胞中诱导衰老表型。基因集富集分析显示，衰老相关上调基因集在处理后的小胶质细胞中显著富集。进一步通过qRT–PCR、免疫染色和分泌因子分析发现，仅小胶质细胞显著上调CDKN2A（p16）和CDKN1A（p21），并增加白细胞介素IL-1β、IL-6、IL-8及TNF等衰老相关分泌表型（SASP）因子。与此同时，细胞内活性氧（ROS）升高，γH2AX阳性细胞核增加，NAD⁺消耗和PARP1活性增强，支持其进入DNA损伤相关衰老状态。细胞周期分析进一步说明，这种衰老并不依赖细胞重新进入分裂周期，而是发生于终末分化的小胶质细胞中。

在“Mitochondrial proteotoxic stress induces a transcriptional state associated with early pathological microglial activation”中，作者进一步将这种应答与疾病相关状态联系起来。虽然撤除药物后部分衰老标志可恢复，但小胶质细胞的免疫反应性已被重塑。预处理后的小胶质细胞在LPS刺激下释放更多IL-1β，而TNF和IL-6释放减少，反映出衰老相关免疫重编程。与人类小胶质细胞图谱比较后发现，这一转录特征与衰老和神经退行性病变中早期病理性小胶质细胞状态高度重叠，尤其是炎症、淀粉样病理、即刻早期基因和热休克反应相关程序。

在“Disease-associated defects in mitochondrial proteostasis induce a senescence-like phenotype in human iPSC-derived microglia”中，研究人员采用PITRM1缺失模型验证疾病相关性。PITRM1是线粒体金属肽酶，参与导入肽段降解，其功能缺失与缓慢进展性神经退行性疾病和Aβ清除障碍有关。PITRM1缺失的小胶质细胞尽管分化正常，但UPR_mt显著激活，并复制了p16/p21上调、SASP因子增加、IL-1β分泌增强、氧化应激上升、γH2AX阳性增加及NAD⁺消耗等表型。相比之下，PITRM1缺失的神经元和星形胶质细胞并未出现相同程度的p21或DNA损伤增加，进一步突出小胶质细胞的选择性易损性。

在“Morphology-based deep learning identifies UPR_mt-driven senescence in human iPSC-derived microglia”中，作者针对非增殖脑细胞衰老难以界定的问题，使用基于核面积、凸性和长宽比等形态特征的深度学习模型进行定量判别。结果显示，无论是CDDO-Me处理还是PITRM1敲除，小胶质细胞的预测衰老评分均显著升高，支持UPR_mt驱动的衰老状态具有可重复的形态学基础。

在“UPR_mt activation dysregulates lipid metabolism in human iPSC-derived microglia”中，代谢组学和脂质组学揭示脂质重塑是该过程的核心机制之一。UPR_mt激活后，小胶质细胞出现显著代谢漂移，涉及甘油磷脂和甘油脂代谢通路紊乱，伴随脂滴分布异常。脂质组分析发现，CDDO-Me模型中磷脂酰胆碱（PC）下降、三酰甘油（TAG）累积，提示细胞向脂质储存状态转变；PITRM1-KO模型虽在TAG绝对水平上呈现不同方向变化，但同样存在脂质代谢失衡。更重要的是，抑制DGAT1/2介导的TAG合成可降低脂滴形成，并减少p21、γH2AX及炎症因子分泌，说明TAG合成是UPR_mt诱导衰老的重要必需环节。

在“UPR_mt activation dysregulates methionine metabolism in human iPSC-derived microglia”及“Targeting SAM metabolism attenuates the senescence phenotype in human iPSC-derived microglia”中，研究进一步指出甲硫氨酸代谢紊乱是另一关键枢纽。处理后的小胶质细胞中，叶酸代谢、半胱氨酸代谢和一碳代谢通路显著异常，表现为甘氨酸、甜菜碱、牛磺酸、胱氨酸和尤其是S-腺苷甲硫氨酸（SAM）下降。尽管抗氧化剂MitoQ可在急性药理应激模型中部分恢复p21、DNA损伤和炎症转录，但在PITRM1-KO模型中不能逆转衰老，提示慢性遗传性线粒体蛋白稳态缺陷的下游机制更为稳固。功能干预显示，外源SAM补充会加剧损伤，而抑制SAM合成酶MAT2A或抑制多胺合成则可降低p21、γH2AX、CXCL8及脂滴积累，说明SAM驱动的代谢通量重分配是连接UPR_mt、脂质重塑和衰老的重要机制。

在“UPR_mt activation induces a microglia-specific senescence phenotype in iPSC-derived tricultures”中，研究人员将观察推进至多细胞环境。三元共培养体系中，CDDO-Me处理仍然选择性提高小胶质细胞的预测衰老评分，而神经元和星形胶质细胞并未表现出同样的衰老增强；PITRM1-KO三元培养结果一致，证明该现象在复杂细胞环境中依旧稳定存在。

在“UPR_mt activation induces cell-type-specific metabolic dysregulation in iPSC-derived tricultures”与“Mitochondrial proteotoxic stress decreases predicted microglia-mediated cell–cell communication and phagocytic signaling in iPSC-derived tricultures”中，单细胞RNA测序和CellChat分析揭示了细胞间通讯层面的重构。CDDO-Me处理后，三元体系总体配体—受体相互作用数量和强度下降，提示全局细胞通讯减弱。分细胞类型分析显示，星形胶质细胞与神经元之间的信号传递增强，而来源于小胶质细胞的自分泌和旁分泌通讯则明显减少。具体而言，小胶质细胞炎症相关ANXA1–FPR1/3和TNF–TNFRSF1A/1B信号增强，但与吞噬和清除相关的SPP1及GRN通路减弱。功能实验进一步证实，小胶质细胞中p62积累、自噬通量下降、溶酶体应激增加，并伴随PSD95在小胶质细胞和整体培养中的积累，提示突触修剪和蛋白清除能力受损。

在“UPR_mt-induced misfolded protein accumulation in senescent microglia is reversed by inhibition of polyamine synthesis”中，作者将上述改变与蛋白聚集病理联系起来。CDDO-Me处理或PITRM1缺失均使小胶质细胞内α-突触核蛋白（α-synuclein）预形成纤维（PFFs）清除受损，导致胞内聚集增加。抑制多胺合成后，这种异常积累显著下降，说明SAM相关多胺代谢参与了错误折叠蛋白清除障碍的形成。

在“Microglial UPR_mt drives senescence and protein aggregation in MgBr assembloids”中，研究人员进一步在含小胶质细胞脑组装体中证实了这一机制的组织层面后果。将PITRM1-KO小胶质细胞整合入野生型皮层类器官后，随着整合时间延长，类器官中p21表达逐步增加，提示衰老表型传播；同时MAP2信号下降，表明神经元完整性受损。Thioflavin T和Aβ染色结果显示，含PITRM1-KO小胶质细胞的组装体中淀粉样聚集显著增加，而磷酸化tau尚未改变，符合较早期神经退行性病理阶段的特征。

讨论部分的核心在于，研究人员重新界定了UPR_mt在人脑中的细胞类型特异性功能。该研究并未否认线粒体应激反应在某些背景下的保护性，但强调在人类小胶质细胞中，持续UPR_mt激活会与整合应激反应（ISR）协同，诱导脂质介导的衰老样神经毒性状态。这一状态以SAM代谢失衡、TAG中心脂质重塑、脂滴累积、吞噬/自噬溶酶体功能减退、炎症信号增强及细胞间通讯受损为特征，最终破坏神经元稳态并促进早期神经退行性病理。研究的重要意义在于，它将线粒体蛋白质稳态缺陷、小胶质细胞衰老和脑内蛋白聚集性病变连接为一个连续病理轴线，提示不能笼统地增强或抑制UPR_mt，而应发展面向小胶质细胞及其下游代谢支路的精准干预策略。

研究结论可概括为：线粒体应激反应具有显著的情境依赖性和细胞类型特异性。尽管线粒体应激在某些情况下可支持神经元蛋白质稳态，但在人类小胶质细胞中，持续的UPR_mt激活会驱动一种由脂质代谢异常介导、并与ISR相关的衰老状态，从而破坏神经元稳态。该结果反对对线粒体应激通路进行无差别调控，而支持采用靶向小胶质细胞的策略，例如选择性调节其下游脂质代谢或一碳代谢分支，以缓解衰老相关和神经退行性病变相关的脑病理。