探索过氧化酶底物驱动的金纳米棒刻蚀技术在间接检测阿米洛伊德β1–42中的应用

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Exploring peroxidase substrates driven etching of gold nanorods towards indirect detection of amyloid beta1–42

　　

E.T. Athira|Jitendra Satija

印度泰米尔纳德邦韦洛尔市韦洛尔理工学院纳米生物技术中心，邮编632014

摘要

等离子体酶联免疫吸附测定法（pELISA）利用贵金属纳米粒子的局域表面等离子体共振特性，相比传统免疫测定法具有更高的灵敏度。通过氧化修饰改变等离子体纳米粒子的几何结构，可产生不同的比色信号，从而开发出超灵敏的现场检测用pELISA。要进一步发展pELISA，需系统研究酶反应与纳米材料，以便精准检测微量生物分子。本研究系统探讨了五种辣根过氧化物酶底物产物对金纳米棒蚀刻效率的影响，这些底物包括3,3,5,5-四甲基联苯胺、邻苯二胺二盐酸盐、2,2-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、3-氨基-9-乙基咔唑和3,3'-二氨基联苯胺。在受控条件下评估了每种底物的作用，以确定其能否引起金纳米棒纵横比相关的光谱变化，进而实现定量比色检测。紫外-可见光谱分析显示，只有TMB的氧化产物TMB_ox2能显著蚀刻金纳米棒，使其LSPR峰出现明显的蓝移。基于优化后的蚀刻方法，我们开发了一种间接竞争型pELISA，用于检测阿尔茨海默病的关键生物标志物——β_1–42淀粉样蛋白，该方法的检测限为0.37?pg/mL（约83.14 fM），显示出其在超灵敏且精准量化生物分子方面的巨大潜力。

引言

等离子体ELISA（pELISA）是一种新型生物分析技术，可用于检测极低浓度的目标分析物[1]、[2]。该技术将贵金属纳米粒子的局域表面等离子体共振特性与传统ELISA相结合。传统ELISA通过酶的作用将无色的显色底物转化为不同色调强度的产物，其颜色强度通常随分析物浓度呈线性增长；但用肉眼难以精确量化，因此需要光学读取器等精密仪器。而pELISA则依靠酶催化下纳米粒子的几何结构变化，在极低分析物浓度下就能产生双色或多色信号，这类信号可用肉眼轻易区分[1]、[3]、[4]、[5]、[6]。通常，酶促反应会改变纳米粒子的大小、形态、组成以及粒子间距离，进而影响其LSPR特性，产生特有的等离子体颜色。此外，金、银等等离子体纳米粒子的消光系数高达10⁸至10⁹?M^?1.cm^?1，远高于3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺等传统过氧化物酶底物（5.9?×?10⁴?M^?1.cm^?1），因此即便在极低浓度下也能产生强烈的颜色[7]、[8]。

在各种pELISA方案中，基于纳米粒子蚀刻的等离子体颜色生成方法因能精准控制酶催化下的形状和/或尺寸变化而备受关注。与其他pELISA方法相比，该方法具有更高的可靠性、更低的检测限、更好的特异性以及更高的灵敏度[9]、[10]、[11]。此外，该方法还能根据分析物浓度产生预定义的多色读数，无需任何仪器即可在现场进行定量检测。

目前已有多种酶被用于实现基于纳米粒子蚀刻的pELISA，如碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶等[12]、[13]。通常，这些酶促反应会产生氧化剂，用于蚀刻（或氧化）纳米粒子。例如，葡萄糖氧化酶可将葡萄糖转化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢，过氧化氢作为氧化剂可蚀刻纳米粒子，从而改变其大小和形状[14]、[15]、[16]。在碱性磷酸酶介导的pELISA中，底物抗坏血酸2-磷酸会被转化为抗坏血酸，后者是一种弱还原剂。随后抗坏血酸会还原碘酸盐并生成碘，碘可作为纳米粒子的蚀刻剂，使其形态发生改变并产生等离子体颜色[17]。同样，过氧化氢酶也可通过芬顿反应产生羟基自由基，从而蚀刻纳米粒子，引发显著的等离子体颜色变化[18]。此外，辣根过氧化物酶也被用于多种pELISA中，它能将无色的底物TMB氧化为带正电荷的黄色产物TMB_ox2[4]、[5]。由于TMB_ox2具有氧化性，它可蚀刻等离子体纳米粒子，改变其大小和形状，同时根据分析物浓度导致颜色和吸收波长的特征性变化。尽管已有多种酶-底物组合被用于pELISA，但辣根过氧化物酶及其底物TMB仍是应用最广泛的组合，被用于多种pELISA方法的开发[4]、[5]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。目前尚未研究过辣根过氧化物酶的其他底物在蚀刻纳米粒子及产生等离子体颜色方面的作用。

本研究系统研究了五种不同过氧化物酶底物的酶促氧化产物，以及它们在蚀刻十六烷基三甲基溴化铵稳定的金纳米棒方面的作用。在所测试的各类物质中，仅有TMB_ox2能显著影响金纳米棒的LSPR特性及相应的比色响应，其余底物则无法蚀刻金纳米棒。基于TMB_ox2介导的金纳米棒蚀刻优化策略，我们进一步开发了一种间接竞争型比色等离子体增强ELISA，用于检测阿尔茨海默病的生物标志物β_1–42淀粉样蛋白，该方法的检测限为0.37?pg/mL（约83.14 fM）。

章节节选

材料

辣根过氧化物酶、十六烷基三甲基溴化铵、三水合氯金(III)酸、硼氢化钠、3,3,5,5-四甲基联苯胺、邻苯二胺二盐酸盐、2,2-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、3-氨基-9-乙基咔唑、3,3'-二氨基联苯胺、康宁? 96孔微孔板、抗坏血酸、生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯以及吐温-20均购自Sigma-Aldrich公司。过氧化氢

金纳米棒的特性分析

通过种子辅助生长法得到的金纳米棒呈棕色胶体溶液。其紫外-可见吸收光谱显示出两个典型的LSPR峰，分别为516?±?2?nm和673?±?9?nm，分别对应横向和纵向等离子体峰（见图1a）。透射电子显微镜分析显示，这些纳米棒呈棒状，平均纵横比为2.85（平均长度为57?±?17?nm，平均直径为20?±?6?nm）（见图1c）。其平均流体力学尺寸为

结论

pELISA是一种创新的诊断方法，它结合了传统ELISA的特异性与贵金属纳米粒子独特的光学特性。基于蚀刻的pELISA通过可控的氧化蚀刻方式调节纳米粒子的LSPR峰，为选择性和高灵敏度的目标分析物比色检测提供了极为强大且灵活的平台。在本研究中，我们评估了多种辣根过氧化物酶底物的酶促氧化产物对金纳米棒蚀刻的效果

CRediT作者贡献说明

Athira E T：概念构思、实验研究、正式分析、撰写初稿。Jitendra Satija：概念构思、研究指导、审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢新德里的科学与工程研究委员会（SERB）提供的资金支持[资助编号CRG/2022/002641]。同时也要感谢韦洛尔理工学院为我们的实验分析工作所提供的基础设施支持。