《Steroids》：Development and validation of an LC-MS method for quantification of sex steroid hormones in skeletal muscle
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性类固醇激素并非仅存在于循环系统中，也存在于许多性腺外组织中，其浓度与循环部分无关。现有的测量肌肉内类固醇激素浓度的方法包括基于免疫的检测方法和液相色谱-质谱联用（LC-MS，激素测量的金标准）。尽管具有明确的生物学相关性，但迄今为止，尚未有基于LC-MS的方
性类固醇激素并非仅存在于循环系统中，也存在于许多性腺外组织中，其浓度与循环部分无关。现有的测量肌肉内类固醇激素浓度的方法包括基于免疫的检测方法和液相色谱-质谱联用（LC-MS，激素测量的金标准）。尽管具有明确的生物学相关性，但迄今为止，尚未有基于LC-MS的方法验证发表用于测量肌肉内性类固醇激素。本文描述了一种简单、高通量的LC-MS Orbitrap方法的开发和验证，用于测量10种肌肉内性类固醇激素，即孕烯醇酮（P5）、孕酮（P4）、脱氢表雄酮（DHEA）、雄烯二酮（A4）、睾酮（T）、表睾酮（EpiT）、双氢睾酮（DHT）、雌酮（E1）、雌二醇（E2）和雌三醇（E3）。简而言之，将同位素标记的内标添加到5-6毫克冻干肌肉组织中，匀浆并用乙酸乙酯萃取。萃取物干燥后，依次用1-甲基咪唑-2-磺酰氯（1M2S）和盐酸羟胺（HL）进行衍生化，以靶向酚羟基和酮基。所有分析物的检测限为1.0 ± 1.0 pg/mg（范围0.36–3.26 pg/mg），所有分析物的R2 > 0.99。除双氢睾酮（143.6%）外，所有分析物的基质效应为90-110%，在肌肉基质存在下，所有分析物的精密度（变异系数）<10%。研究人员的方法允许在约4小时内制备20-40个样品，每个样品的数据采集时间为13分钟。此外，该方法为特异性分析骨骼肌中的类固醇激素浓度提供了机会，实现了靶组织特异性，而非依赖于循环中的替代测量指标。
**论文解读：骨骼肌性类固醇激素LC-MS定量分析方法的开发与验证**
**一、研究背景与意义**
性类固醇激素是源自共同前体胆固醇的强效内分泌信号分子，主要在性腺和肾上腺合成。它们分泌入血后，被转运至靶组织，并以紧密结合于结合蛋白、松散结合或未结合的形式存在，后两者构成了生物可利用的激素部分。除非被紧密结合，否则类固醇激素可以自由结合其胞质受体，然后转位入细胞核，调节多种基因的表达。骨骼肌就是这样一个靶组织。例如，雄激素受体（AR）经典信号通路使睾酮能够结合AR并上调控制肌肉肥大的基因。同样，雌激素可能进入骨骼肌细胞，结合雌激素受体（ER），并在细胞核水平调节基因表达。孕酮受体（PR）也已在骨骼肌组织中被检测到，但孕酮与其受体的相互作用尚不清楚，据推测孕酮可能能够结合ER并拮抗雌激素的作用。此外，所有性类固醇激素的共同前体孕烯醇酮缺乏特定的核受体，其是否在骨骼肌中发挥直接作用尚不明确。
性类固醇激素也可能在包括骨骼肌在内的性腺外组织中合成。3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）、17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）、芳香化酶（P450arom）、3-氧代-5α-类固醇-4-脱氢酶（5α-还原酶）的转录本均在骨骼肌中表达，使得类固醇激素能够进行局部酶促转化。虽然易位蛋白（TSPO）、类固醇生成急性调节蛋白（StAR）和细胞色素P450家族11亚家族A成员1（CYP11a1）已在鼠类和禽类肌肉中被检测到，但StAR和CYP11a1在永生化小鼠骨骼肌细胞（C2C12）或大鼠肌肉中无法检测到，在人类肌肉中表达水平也非常低。这表明，骨骼肌内从胆固醇进行从头类固醇生成的能力可能在不同物种间并不保守，反而可能更依赖于不依赖胆固醇的硫酸酯酶途径作为所有性类固醇激素的初始前体孕烯醇酮的来源。
先前研究表明，循环和肌肉内的性激素浓度并不显著相关，可能受到独立调节。这种现象在包括大脑和脂肪组织在内的多种组织中均有记载，并可能延伸至骨骼肌。事实上，在一项对绝经后双胞胎（其中一位使用含雌激素的激素替代疗法）肌肉内雌二醇（E2）水平的比较中，肌肉内E2浓度并未受到治疗状态的影响。肌肉内激素浓度似乎也因肌肉的纤维类型组成而异。因此，肌肉内激素状态无法从基于血液的测量中推断出来，这引发了关于其与肌肉内激素状态可转化性的疑问。
在临床环境中，可以抽取静脉血样并通过成熟的基于质谱的方法分析循环激素浓度。然而，先前大多数关于肌肉内性激素、衰老以及肌肉质量和功能之间相互作用的研究都受到免疫测定法使用的限制。虽然现代免疫测定法显示出高准确性且操作简便，但与金标准方法质谱法相比，在低激素浓度下测试时，其测量变异性会增加。此外，类固醇激素免疫测定法容易受到与目标类固醇分子结构相似的化合物引起的交叉反应影响。除了未知的肌肉基质效应外，这些测定法还缺乏同时定量多种类固醇激素的能力。
性类固醇激素即使在低浓度下也能发挥显著的生理效应，这给准确分析带来了进一步的分析挑战。虽然液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析不一定需要化学衍生化，但衍生化可以增强检测灵敏度。对于酚羟基类固醇（如雌激素），通常使用诸如丹磺酰氯之类的试剂进行磺酰化。靶向雌激素的1-甲基咪唑-2-磺酰氯（1M2S）可以将检测灵敏度提高数倍。皮考啉酸衍生化已应用于羟基类固醇（如睾酮、DHT），形成皮考啉酸酯以增强检测灵敏度。同样，酮类固醇已成功使用盐酸羟胺（HL）、吉拉德试剂、2-肼基-1-甲基吡啶和2-肼基-4-三氟甲基嘧啶进行衍生化，从而提高了检测灵敏度。尽管所有性类固醇激素的环戊烷多氢菲四环结构基本相同，但官能团的差异对化学衍生化提出了挑战，以增加对不同结构化合物的检测灵敏度。因此，有必要开发高灵敏度和集成化的方法，能够在单次分析运行中靶向广泛的、不同类别的类固醇及其相关化合物。
虽然LC-MS已用于多项研究来测量肌肉内性激素，包括在一篇分析多种组织激素浓度的方法学论文中，但专门针对肌肉内性类固醇激素的LC-MS分析方法缺乏分析验证。尽管LC-MS的使用情况不一，但基于免疫测定的方法在肌肉内性激素测量中仍然很常见。因此，研究人员开发并验证了一种基于LC-MS的简单方法，采用两步衍生化方案，用于同时定量骨骼肌组织中的十种性类固醇激素。该研究发表于《Steroids》期刊。
**二、关键技术方法**
本研究开发并验证了一种用于定量骨骼肌内雄烯二酮（A4）、脱氢表雄酮（DHEA）、双氢睾酮（DHT）、表睾酮（EpiT）和睾酮（T）等雄激素；雌酮（E1）、雌二醇（E2）和雌三醇（E3）等雌激素；以及孕酮（P4）和孕烯醇酮（P5）等孕激素浓度的两步衍生化策略。方法开发中，研究人员首先尝试仅使用盐酸羟胺（HL）作为衍生化试剂，但无法以足够的灵敏度检测E2和E3。为了将主要的雌性激素E2以及通常与妊娠相关的E3纳入研究，研究人员采用了1-甲基咪唑-2-磺酰氯（1M2S）和HL的序贯衍生化：先用1M2S衍生化所有雌激素，再用HL衍生化所有雄激素和孕激素。样本来源于人类（健康男性和女性各一例的股外侧肌活检）和小鼠（C57BL/6品系，16周龄静息雄性和雌性各一例的多种肌肉组织，包括比目鱼肌、趾长伸肌和膈肌），均获得了相关伦理委员会批准。方法验证包括在肌肉基质存在和不存在的情况下建立标准曲线、计算检测限（LOD）和定量限（LOQ）、评估精密度和基质效应等。所有分析均使用Vanquish Flex液相色谱系统与Orbitrap Exploris 240质谱仪联用平台进行，数据采集采用全扫描和靶向选择性离子监测（tSIM）模式。
**三、研究结果**
**3.1 衍生化策略与色谱行为**
通过序贯使用1M2S和HL进行衍生化，成功实现了对十种目标激素的同时检测。1M2S对所有目标分析物产生单峰，而HL衍生化导致了一些类固醇（如T、DHT、EpiT和P4）形成立体异构体，产生两个色谱峰。对于未完全分离的异构体峰，研究人员整合了两个峰的面积进行定量。所有分析物在2至6分钟内洗脱，整个LC-MS采集时间为13分钟。样品制备（20-40个样品）约需4小时。
**3.2 方法学验证结果**
* **线性与范围**：在肌肉基质存在下，所有分析物的校准曲线均表现出良好的线性，R
2 > 0.99。
* **检测限与定量限**：从约5.2毫克冻干肌肉组织中提取时，LOD为1.0 ± 1.0 pg/mg（范围0.36–3.26 pg/mg），LOQ为3.0 ± 2.9 pg/mg（范围1.10–9.89 pg/mg）。其中睾酮的LOD（3.26 pg/mg）和LOQ（9.89 pg/mg）最高，线性范围起始于13.2 pg/mg。
* **精密度**：所有分析物在低、中、高三个浓度水平的变异系数（CV%）均<10%，表明方法精密度高。
* **基质效应**：除DHT的基质效应为143.6%外，其余所有分析物的基质效应均在90%至110%之间。
* **残留与特异性**：在高浓度样品后进样空白样品，未检测到残留。方法能够特异性区分和定量目标激素。
**3.3 实际样本检测**
研究人员应用该方法测定了人类男女性受试者股外侧肌以及小鼠不同肌肉组织（趾长伸肌、比目鱼肌、膈肌）中的激素浓度。数据显示了肌肉内激素浓度的存在及种属、性别和组织间的差异。例如，在人类样本中检测到了孕烯醇酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮等激素。在小鼠肌肉中也检测到了多种激素，其浓度范围与已发表文献中雌性C57BL/6小鼠腓肠肌的数据有重叠。研究指出，由于缺乏完全不含激素的肌肉基质，方法验证受到限制，且肌肉内激素的量化可能受到内源性背景激素的影响。
**3.4 肌肉内激素来源的探讨**
研究指出，该方法能够测量肌肉内现存的激素浓度，但无法区分这些分子的来源。骨骼肌表达合成性类固醇激素所需的酶，且肌肉内激素部分似乎与相应的循环激素部分不相关，因此有理由认为至少部分测量到的肌肉内激素是在肌肉组织内局部产生的（无论是从头合成还是由循环类固醇前体转化而来）。尽管不能完全排除残留血液污染，但多项证据表明其不会对肌肉内激素信号产生有意义的贡献，例如肌肉内与血浆中DHT浓度无相关性，且质量平衡考虑表明观察到的肌肉内DHT浓度无法用血浆残留来解释。
**3.5 仪器平台与验证的考量**
方法验证使用的是Orbitrap Exploris 240仪器。虽然Orbitrap仪器适合探索性工作，但对于低丰度化合物的靶向定量，三重四极杆平台通常性能更优。因此，对于常规的肌肉内激素浓度检测，有必要使用三重四极杆方法进行验证，但这同样受限于缺乏无激素肌肉基质。一些组织研究使用氯化钠溶液作为替代的无激素基质，但盐水无法模拟肌肉组织的生物复杂性。因此，开发无激素肌肉基质是进行稳健的组织特异性方法验证的前提。
**四、讨论与结论**
**讨论部分总结**：研究人员讨论了他们开发的方法相对于现有技术的优势与局限性。该方法成功实现了对骨骼肌中三大类十种性类固醇激素的高通量、高灵敏度同时定量，克服了免疫测定法交叉反应、单次检测种类有限以及依赖循环替代指标的不足。研究强调了肌肉内激素局部合成与调节的重要性，以及直接测量组织内浓度的必要性。同时，研究也坦诚指出了当前方法的局限，主要是缺乏真正的无激素肌肉基质进行完美验证，这影响了LOD/LOQ的准确评估，并可能使低浓度加标样品的定量受到内源性背景干扰。此外，使用Orbitrap平台虽适合本研究，但对于常规低浓度检测，三重四极杆质谱可能更具优势。研究人员还提出了未来方法学改进的方向，如开发有效的肌肉基质去除激素技术或合成模拟基质，以及在不同质谱平台上进行交叉验证。
**研究结论翻译**：虽然骨骼肌的异质性和富含成分的特性对准确的方法验证提出了挑战，但研究人员开发并验证了一种基于LC-MS的时间高效且高通量的方法，用于从骨骼肌组织中灵敏地同时定量雄激素、雌激素和孕激素，所有分析均在同一次13分钟的分析运行中完成。这种方法克服了基于血液替代测量指标的局限性，从而为肌肉内性类固醇激素浓度提供了直接的研究途径。
