《Small Methods》：Analytical Ultracentrifugation in Different High-Density Media Allows to Assess Heterogeneity of mRNA-Lipid Nanoparticles
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本研究论证了分析型超速离心（analytical ultracentrifugation, AUC）技术用于评估信使核糖核酸-脂质纳米粒（mRNA-lipid nanoparticles, mRNA-LNPs）形态学均一性的能力。研究在纳米粒密度评估标准方法的
本研究论证了分析型超速离心（analytical ultracentrifugation, AUC）技术用于评估信使核糖核酸-脂质纳米粒（mRNA-lipid nanoparticles, mRNA-LNPs）形态学均一性的能力。研究在纳米粒密度评估标准方法的基础上，证实了为实验选择适当液体介质的重要性。研究人员揭示了氘代缓冲液与基于脂质的颗粒水相区室之间的相互作用。通过研究致密实心颗粒、脂质体（liposomes）和脂质纳米粒（lipid nanoparticles, LNPs）的沉降行为，研究人员证实AUC能够检测mRNA负载的脂质纳米粒中充水的空腔结构。因此，研究人员建议，在含蔗糖缓冲液和氘代溶剂中同时进行沉降速度实验，不仅能获得关于密度的宝贵信息，还能获得关于批次均一性和颗粒形态的宝贵信息。
**研究背景与问题提出**
脂质基纳米粒，包括脂质体和脂质纳米粒制剂，约占全球纳米医药市场份额的50%。其中，用于核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）递送的脂质纳米粒近年经历了快速增长，这主要得益于其在2019冠状病毒病（corona virus disease 2019, COVID-19）疫苗及其他新型疗法中的应用。目前，脂质基纳米粒的粒径表征通常采用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）或纳米粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）等测量扩散系数的方法。然而，这些方法在获取形态学和结构学信息方面存在局限。虽然透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM），特别是冷冻透射电子显微镜（cryogenic-TEM, Cryo-TEM）能够提供更深入的形态学信息，但传统TEM制备方法可能引入染色伪影，并在真空环境中损害颗粒的结构完整性，这使其在脂质纳米粒表征中的应用变得复杂。因此，开发适用于水相缓冲液的高通量、经济且真正正交的离心沉降方法具有重要意义。
离心沉降方法的原理在于沉降速度不仅取决于颗粒粒径，还取决于密度（及形状），因此能够提供额外的密度信息，在药物产品开发过程中极具价值。已有研究表明，脂质纳米粒的密度与其RNA含量相关。然而，线起始离心方法（line-start centrifugal methods）在脂质基纳米粒中的应用远少于无机纳米粒，主要原因是脂质基纳米粒的密度较低（0.85–1.05 g/mL），这限制或完全阻碍了其在蔗糖密度梯度中的沉降测量。虽然已有报道利用离心场流分离技术测定脂质体密度，但并非所有商用仪器都能达到合理分离所需的转速。相比之下，分析型超速离心（AUC）技术能够胜任这一任务，适用于进行沉降速度测量，便于在天然缓冲液中基于沉降系数分布进行批次比较，并可通过DLS测量水动力学粒径或采用密度匹配法估算纳米粒密度。AUC是纳米粒表征中成熟且经验证的技术，国际标准化组织（International Organisation for Standardisation, ISO）已颁布密度计算的标准文件。
该标准的基本原理是：当颗粒粒径和密度均未知时，在两种不同密度的液体介质中测量沉降速度，利用斯托克斯方程（Stokes equation）计算这两个参数。根据ISO文件，推荐以D?O作为第二种溶剂替代水，这对无机颗粒尤为有效。然而，D?O可能与含有水分子的系统（如水化层）或结构中易交换氢原子的物质（如多元醇）发生相互作用，从而妨碍D?O基溶剂在各种纳米医药颗粒中的直接应用。本研究表明，这对于含有水相空腔和/或囊泡（bleb）的相分离LNP结构确实如此。尽管这在选择适当高密度缓冲液时看似局限，但数据显示这恰恰为检测mRNA负载脂质纳米粒中形成水相空腔时的相分离现象提供了机会。
**主要技术方法概述**
研究人员采用的核心技术方法包括：（1）分析型超速离心（AUC）技术，使用配备吸收光和干涉光检测系统的Proteomelab XL-I型分析型超速离心机，在2孔钛转子中进行沉降速度实验，PS颗粒转速为30 000 rpm，脂质体和脂质纳米粒为10 000 rpm；（2）动态光散射（DLS）技术，使用Zetasizer Nano ZS仪器，在25°C条件下测量水动力学粒径；（3）冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）技术，使用JEOL JEM-2100型显微镜（120 kV）或FEI LaB? G2 TEM型显微镜（200 kV），对经预浓缩和速冻处理的样品进行形态学观察；（4）密度计算与理论预测建模，依据ISO标准方法，结合斯托克斯定律，利用Sedfit v17软件的ls-g*(s)模型进行数据拟合，并通过理论计算预测颗粒在氘代溶剂中的沉降系数分布；（5）样品制备方面，聚苯乙烯标准微球购自Malvern Panalytical公司，PEG化脂质体通过微流控合成仪（NanoAssemblr Ignite）制备，mRNA-LNPs包括紧凑型（KC?/DSPC/胆固醇/PEG-DMG配方）和含PolyA负载的LNPs（ALC0315配方），后者经离心洗涤和过滤灭菌后于4°C储存。
**研究结果**
**2.1 致密实心颗粒的沉降行为**
研究人员以聚苯乙烯（polystyrene, PS）微球为模型，阐释了致密实心颗粒在沉降速度实验中的行为。这些颗粒具有较好的单分散性，且粒径范围与纳米医药产品相关。离心速度实验中，PS颗粒在水中沉降，在95% D?O中上浮。随着液体介质密度增加，沉降系数（s）分布的模值向低值偏移。当模值接近零时（颗粒密度接近介质密度），检测到的沉降系数分布峰更窄；当液体与颗粒密度差异较大时，分布峰更宽。黏度校正后的沉降速度与液体密度在整个研究范围内呈现优异的线性相关性，表明任意两个测量点均可用于确定颗粒密度。在液体密度与颗粒密度匹配时，沉降速度变为零。使用单一密度值（1.054 g·cm?3）从不同沉降系数分布计算得到的粒径分布表现出良好的重叠性，即使在两种液体密度极端条件下（水和95% D?O）也是如此。这证实了离心沉降实验中观察到的不均一性（峰肩）主要源于不同粒径颗粒群体的存在，而非或仅在较小程度上源于密度变异。AUC获得的粒径分布与DLS测量结果相当，但AUC提供更佳的分辨率。
**2.2 脂质体在不同缓冲液中的沉降行为**
研究人员利用内部制备并储存于磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）中的PEG化脂质体进行实验，其在Cryo-TEM图像中呈现单囊泡形态。沉降实验分别在PBS、D?O配制的PBS和25%蔗糖/PBS中进行，以保持相同的盐浓度。结果显示，脂质体在含水土建PBS溶液中沉降，在25%蔗糖/PBS中上浮。根据±蔗糖/PBS实验确定的密度为1.005 g·cm?3。主群体粒径（模值82 nm）略小于DLS测量的强度加权水动力学直径分布（约106 nm），两者在合理范围内一致，考虑到DLS作为体积方法的固有限制——较大颗粒因其更高散射强度可能掩盖较小颗粒。
然而，使用氘代溶剂中检测到的上浮速度计算得到的密度较高（1.011 g·cm?3），据此转换的粒径分布（约60 nm）远小于DLS测量值.Firstly, this non-ideal behavior in D?O可通过比较理论预测s分布与实际测量分布直观呈现：氘代液体中测量分布的模值出现在比预期更低的绝对值位置。最可能的解释是脂质体与液体介质发生相互作用——若周围液体与脂质体内部水相区室之间发生D?O-H?O（或氘-氢离子）交换，脂质体密度在实验过程中增加，导致上浮速度低于预期，以及离心沉降计算的斯托克斯直径与DLS测量水动力学直径不匹配。
研究人员进一步阐释，D?O-H?O（或氘-氢离子）交换跨脂质双层膜的发生并非意外。虽然脂质双层的水含量很低——疏水核心据报道约含每个脂质分子一个水分子，但水和H?离子通过脂质双层的快速扩散是文献充分记载的现象，且已知依赖于膜组成。虽然胆固醇和饱和脂肪酸链通常被认为可降低水通透性，但胆固醇已被证实可增加H?通量。水分子通过双层疏水核心的扩散系数估计仅比自由水分子低三个数量级。D?O和D?离子预期与H?O和H?离子行为相似，可从缓冲介质穿过膜进入脂质体内部空腔。
此外，这些脂质体在氘代溶剂中对应于?85 S沉降系数的密度约为1.074 g·cm?3，相比H?O中沉降系数计算的表观密度增加了6.8%，这等于体积不变假设下的质量增加百分比。具体而言，考虑70 nm水相核心（脂质双层厚度5–6 nm）并将核心中所有H?O分子替换为D?O，估算的颗粒质量增加约为6.7%，与密度增加高度吻合。这表明核心中的大多数H?O分子以及很可能水化层中的分子都被交换为D?O。在H?1?O水中观察到的类似行为和颗粒质量增加进一步证实了这一假设：不仅D?和H?离子，水分子也能够扩散通过脂质双层，使水相空腔在很短时间内完全交换以达到与外部水相的平衡。
基于DLS与AUC粒径分布的良好一致性，±蔗糖/PBS实验确定的密度可被认为是可靠的。这些结果表明蔗糖不会渗透PEG化脂质体的脂质双层。蔗糖以及其他小分子糖类如海藻糖，是众所周知的冷冻保护剂和脂质双层稳定剂。此外，蔗糖溶液已被证明适用于药物负载脂质体（如Doxil）的密度测定密度匹配实验。
此外，与纳米粒跟踪分析（NTA）结果的比较表明，AUC可能更擅长检测低散射和/或小粒径的颗粒群体，这些群体可能低于NTA的检测限。
**2.3 mRNA负载脂质纳米粒在不同缓冲液中的沉降行为**
mRNA-LNPs的密度非常接近水，但仍依赖于其mRNA负载量。它们通常在PBS中上浮，在更高密度的介质如氘代溶剂或25%蔗糖/PBS中上浮更快。
紧凑型、近似理想的mRNA-LNPs——即使含有一些内部水——其行为与PS颗粒非常相似。它们致密的疏水核心不易被溶剂分子接近，PEG化表面稳定了颗粒，使得蔗糖含介质和D?O基溶剂均可用于AUC实验。其密度和粒径可基于各种D?O浓度下的AUC实验良好估算。理论预测的D?O中沉降系数分布与实验测量分布的模值非常接近（约?120 S），虽理论分布略宽。峰的不完全重叠最可能源于LNP群体内的密度异质性，例如较大的颗粒可能因更大的mRNA负载而具有略高的密度。
然而，根据其组成或生产方法不同，或经去稳定化处理后，mRNA-LNPs在Cryo-EM图像中常显得不够紧凑、不够球形。这类颗粒经常表现出水相区室形式的内部空腔，或被连接到富含脂质的疏水核心上的单层或多层膜包围。这些不够紧凑的脂质纳米粒在含水和25%蔗糖含缓冲液中均上浮，但在蔗糖存在下显示更宽的沉降系数分布，并向更负的沉降系数值偏移，这是由于介质密度更高所致。
在氘代溶剂中，最初呈现单模的颗粒群体解析为多个亚群体，以不同速度上浮，其中一些表现出比理论计算更低的上浮速度。基于脂质体的观察，研究人员提出这是沉降介质与LNP内部水相区室类似相互作用的结果。研究人员假设溶剂分子或其氘和氢离子的交换改变了颗粒密度。这种密度变化的程度取决于疏水脂质富集核心与水填充区室的相对体积，并可能进一步受到颗粒多层性和几何形状的影响。溶剂诱导的颗粒密度增加导致更慢的上浮，表现为测量沉降系数分布向较不负的值偏移，相比理论预期分布。
由±蔗糖/PBS测量确定的密度可将沉降系数分布转换为粒径分布。即使对于不够紧凑的颗粒，这种导出粒径分布与DLS测量的强度加权分布也具有良好的吻合性。
**研究结论与意义**
表征脂质基纳米医药的AUC技术需要特殊考量，不同于分析致密的聚合物或金属基纳米粒。由于其脆弱性，沉降速度必须适度以避免破坏性剪切力。本研究采用10 000 rpm的速度，与脂质体和脂质纳米粒均兼容——这由DLS和AUC粒径结果的良好一致性所证实。
由于沉降速度同时依赖于粒径和密度，通过DLS等正交技术或多种液体中的多次AUC运行来同时测量是必要的，以解耦这些参数。对于多次速度AUC实验，颗粒的天然缓冲液通常是首选的沉降介质，因为AUC实验可便捷地在这些缓冲液中进行，只需简单稀释即可。研究结果表明，使用蔗糖溶液作为第二种沉降介质优于D?O基缓冲液，因为蔗糖不会渗透脂质双层，因此不会进入脂质体或LNPs；而氘代溶剂可能与这些纳米粒内部的水填充区室发生相互作用。另一方面，这种溶剂-颗粒相互作用可被实验性地利用。具体而言，蔗糖溶液和氘代溶剂测量之间的差异可能揭示水负载空腔的存在，从而为LNP群体内的颗粒非均质性提供宝贵信息。
沉降速度也受颗粒形状影响，但许多纳米医药产品包括脂质体、乳剂和脂质纳米粒可合理地近似为球形。偏离紧凑球形颗粒形态的情况可能根据最终应用而或期望或不期望。虽然Cryo-TEM仍是可视化形态学差异的金标准，但研究结果表明AUC是检测不同形态的有前景的方法，并可提供关于颗粒均一性的宝贵信息，可作为颗粒稳定性和储存条件测试研究中的有用工具。该方法也有明确的局限性：虽然D?O-水交换揭示样本异质性，但mRNA-LNPs中粒径、形状和组成变异的同时存在，阻止了使用简单脂质体模型对其内部水相体分数的可靠定量估算。与Cryo-EM相比，AUC提供更高的通量，并允许在天然缓冲液和液相中研究纳米医药，无需冷冻。与NTA相比，AUC提供了也能检测较小、低散射颗粒群体的工具。此外，使用更高密度溶剂（如本研究介绍的蔗糖溶液）可增加上浮速度并缩短实验时间，可能使更低速度因而更低成本的离心方法得以应用。
