基于多糖手性固定相的超临界流体色谱法同时分离依折麦布及其七种立体异构体：方法优化与热力学分析

《Talanta》：Simultaneous separation of ezetimibe and its seven stereoisomers by supercritical fluid chromatography on a polysaccharide-based chiral stationary phase: Optimization and thermodynamic analysis

　　

李万杰|金伟|陈阳|朱立平|郑露霞|乐健|刘浩

中国上海201203，复旦大学药学院

摘要

采用超临界流体色谱法研究了依折麦布及其七种立体异构体的分离行为。使用基于多糖的手性固定相来系统评估柱型、修饰剂组成与比例、柱温以及背压对分离效果的影响。最终在Chiralpak AD-H柱上，以甲醇和异丙醇的混合液（体积比1:1）作为有机修饰剂时获得了最佳分离效果。流动相的流速、柱温及背压分别设定为2 mL/min、40°C和2200psi。不同对映体对的柱温影响存在差异，其中/RSS对映体对的洗脱顺序出现了明显反转。方法验证结果显示，依折麦布及其七种立体异构体在其各自的校准范围内均表现出优异的线性关系，校准范围覆盖1.46–111.89 μg/mL，相关系数均高于0.999。各分析物的检测限和定量限分别介于0.6至3.5 μg/mL以及1.3至10.6 μg/mL之间。该方法已成功应用于原料药和片剂样品中依折麦布立体异构体的测定，证明了其在常规质量控制中的适用性。这些结果表明，所开发的超临界流体色谱法高效、可靠，适用于依折麦布及其立体异构体的定量分析。

章节节选

化学品与试剂

依折麦布（纯度99.9%）及其各种立体异构体——SSR（纯度99.7%）、RSR（纯度98.2%）、SSS（纯度99.1%）、RRS（纯度99.1%）、RRR（纯度98.2%）、RSS（纯度98.3%）和< />（纯度99.6%）——均购自中国广州的CATO Research Chemicals Inc.。在系统适用性溶液中所用的浓度为1.0 mg/mL时，检测了每种参考标准的立体异构体纯度（见图S1）。所用试剂为HPLC级甲醇、乙醇等。

固定相对手性分离的影响

在开发对映体分离方法时，选择合适的固定相至关重要，因为其类型和相互作用机制直接决定了分离的选择性和效率[21]。由于具有多种相互作用机制（如氢键、π-π相互作用以及空间匹配效应），且应用范围广泛，基于多糖衍生物的固定相通常是手性方法开发中的首选[22]。

在本研究中，共使用了四种基于多糖的色谱柱。

方法验证

对于像依折麦布及其多种立体异构体这样的复杂混合物，如何在保证早洗脱峰的分离度的同时，兼顾分析时间以及晚洗脱峰的峰形，往往是一个挑战。通过梯度洗脱精确调整有机修饰剂的比例，可以动态调节流动相的溶剂强度和密度。基于之前的方法优化结果，最终选择了梯度洗脱程序作为最优方案。

与已有方法的比较

为体现本方法的优点，将当前研究结果与以往报道的用于分离依折麦布立体异构体的方法进行了比较，结果总结于表S3中。大多数已报道的液相色谱方法都是利用反相C18柱或正相手性柱，试图将依折麦布与其一种或几种立体异构体杂质分开。虽然有些方法能够实现某些选定立体异构体的良好分离，但它们的分离覆盖范围较为有限。

结论

本研究开发了一种具有立体选择性的超临界流体色谱法，可用于依折麦布及其七种立体异构体的同步分离与定量分析。在所有测试的基于多糖的手性固定相中，CHIRALPAK AD-H柱结合甲醇/异丙醇（体积比1:1）作为有机修饰剂时，分离效果最佳，能够在40分钟内实现八种立体异构体的基线分离。温度和背压的影响表明，分离行为与化合物种类密切相关。从热力学角度分析……

作者贡献说明

刘浩：指导工作。乐健：指导工作。郑露霞：指导工作、提供资源支持。朱立平：提供资源支持。陈阳：提供资源支持、参与方法构思。金伟：负责文章撰写与修改、指导工作、项目管理、方法设计、资金申请以及方法构思。李万杰：负责文章撰写与修改、初稿撰写、方法验证、实验研究、数据整理以及方法构思。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

作者感谢上海科学行动计划科技创新项目基金（编号22142201800）的资助。本文内容完全由作者负责，不一定代表这些资助机构的官方观点。