三酰甘油对映体及位置异构体在不使用流路再循环的手性液相色谱-质谱联用柱串联分离方法（Column Coupling for Chiral LC-MS Separation Resolves Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers in Complex Samples Without Flow Recycling）

《Talanta》：Column coupling for chiral LC-MS separation resolves triacylglycerol enantiomers and regioisomers in complex samples without flow recycling

　　

摘要：甘油骨架上脂肪酸的位置分布使三酰甘油（Triacylglycerol, TG）产生多种位置异构体（regioisomer）和对映体（enantiomer），其吸收、代谢及组织分布各异；脂肪酸双键位置异构进一步增加了分析难度。为提高此类异构体分辨能力，研究人员将手性液相色谱（Chiral Liquid Chromatography, Chiral LC）与电喷雾电离高分辨质谱（Electrospray Ionization High-Resolution Mass Spectrometry, ESI-HRMS）联用。采用直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相（Chiralpak IF-3）分离对映体与位置异构体，并考察关键色谱参数——流动相组成、柱温及流速。选定乙腈/水（98:2, v/v）为流动相，柱温35 °C，流速0.15 mL/min进行对映体与位置异构体分离；三根柱串联（总长750 mm）可提升关键对映体与位置异构体的柱效与分离度（Resolution, Rs）。此外该方法可区分因双键位置及顺式(cis, Z)/反式(trans, E)构型不同而异的TG，而常规反相色谱（Reversed-Phase, RP）难以实现。该方法在肝基质中保留时间稳定，对映体百分比测定重现性良好。应用于大鼠肝提取物发现常规RP-LC-MS未检出的立体化学TG多样性；阿霉素（Doxorubicin, Dox）处理后检测到对映体分布差异，凸显了TG异构体解析于生物样品中的重要性。综上，本研究建立了稳健的质谱兼容脂质组学手性分析平台，用于TG立体特异性分析，为脂质重塑（Lipid Remodelling）与从头脂生成（De Novo Lipogenesis）的立体化学层面研究提供分析基础。

Nilsson等人在《Talanta》发表的研究指出，三酰甘油（Triacylglycerol, TG）因甘油骨架sn-1/2/3位脂肪酸分布不同可产生位置异构体（regioisomer，sn位差异的非对映异构体）及对映体（enantiomer，sn-1与sn-3脂肪酸不同时甘油sn-2碳为手性中心产生的一对镜像异构体），加之脂肪酸碳链双键位置及顺式(cis, Z)/反式(trans, E)几何异构，使单一分子式对应多种具不同生理活性的立体化学物种。常规非水反相液相色谱（Non-aqueous Reversed-Phase Liquid Chromatography, NARP-LC）或银离子色谱（Ag⁺-HPLC）难以基线分离TG对映体，质谱自身不能区分对映体，酶解法或衍生化引入额外步骤且无法直接色谱分离对映体；已有多糖基手性固定相（Chiral Stationary Phase, CSP）多依赖柱切换再循环（flow recycling）或超长分析时间（＞150 min），限制了复杂生物样本中TG立体异构的高通量解析。为此研究人员系统优化了基于直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)CSP（Chiralpak IF-3）的串联柱LC-ESI-HRMS方法，在不使用再循环装置下实现对复杂肝组织TG对映体、位置异构体及双键位置/Z-E异构体的分离与定量，并验证其在生物样本中检测立体化学变化的可行性。

主要关键技术方法

采用雄性Wistar Han IGS大鼠（对照组腹腔注射生理盐水，处理组腹腔注射阿霉素Dox 10 mg/kg，n＝各1只用于方法学展示），禁食16 h后麻醉取肝组织?80 °C保存。肝匀浆经冷乙腈/甲醇（1:9, v/v）沉淀蛋白与极性脂质，沉淀以异丙醇/乙腈（1:1, v/v）重溶富集TG。色谱系统为Waters Acquity UPLC I-Class FTN进样，三根Chiralpak IF-3（250 × 2.1 mm, 3 μm）串联，流动相乙腈/水（98:2, v/v）等度洗脱，柱温35 °C，流速0.15 mL/min，进样1 μL；柱后T型管以3.0 μL/min汇入50 mM甲酸铵溶液促进[TG＋NH₄]⁺加合离子生成。质谱为正模式ESI-Q-ToF（Waters Synapt G2S）扫描m/z 450–1200，毛细管电压＋2.0 kV，锥孔电压＋60 V，脱溶剂温度450 °C。部分条件筛选实验采用Xevo TQ-S micro三重四极杆。TG标准品含rac-及sn-纯品（Larodan），以氯仿→异丙醇→异丙醇/乙腈逐步稀释至0.25 μg/mL。数据分析计算理论塔板数N＝5.54(t_R/w_0.5)²、对映体选择性α＝k₂/k₁、峰谷比（peak-to-valley, p/v）、分辨率R_s＝1.18(t_R2－t_R1)/(w_0.5,1＋w_0.5,2)，对映体百分比＝对映体峰面积/对映体对总面积×100％，采用线性混合效应模型评估日内/日间变异。

研究结果

3.1 对映体与位置异构体的分离

以rac-LLS（sn-LLS/sn-SLL）、rac-PPL、rac-OOP、rac-PPO及无手性位置异构体sn-PLP、sn-POP、sn-OPO为模型物系统考察色谱参数。

—流动相组成影响：纯异丙醇（IPA）完全消除对映体分离；纯甲醇（MeOH）较乙腈（ACN）保留更强、对映选择性略高（rac-LLS p/v≈1.19 vs 1.85，α≈1.09 vs 1.07）并可分离sn-PPO/sn-OPP对，但MeOH下sn-PLP与sn-PPL完全共流出；ACN可实现sn-PLP与sn-PPL/sn-LPP对映体组的初步分离。MeOH/ACN任意比例混合或加入微量IPA均使对映体分离丧失或显著降低，提示两种溶剂在TG与CSP相互作用中主导不同保留机制（可能分别为类亲水作用HILIC-like与反相RP-like），混合后破坏手性识别。最终因需兼顾位置异构分离选ACN体系。

—柱温影响：MeOH作流动相时升温（25→35 °C）提高N但对α、p/v、R_s几无影响；ACN作流动相时升温降低对映分离度（p/v增大），低温有利分离但不足以满足复杂样本，故选折中35 °C用于串联柱评价。

—流速影响：降低流速（0.30→0.08 mL/min）显著提高N（降低传质阻力贡献），α基本不变，R_s随N升高而改善；MeOH下降流速仍无法基线分离sn-PLP/sn-PPL，ACN虽对映分离略弱但能分位置异构且分析时间短，排除MeOH。

—ACN中加水影响：加≤2％（v/v）水略增R_s，α不变；＞2％水保留时间剧增但R_s不再提高，选定ACN/H₂O（98:2, v/v）。

—分离长度（柱串联）影响：单柱→双柱→三柱串联（250/500/750 mm），N近似线性增加，所有测试对映体与多数位置异构体R_s提高，三柱使rac-LLS、rac-PPL/LPP/PLP等对达基线分离（R_s≥1.5），全不饱和FA的TG（如rac-LLO/LOL）三柱可部分分离其位置异构。最终条件：三根Chiralpak IF-3串联，ACN/H₂O（98:2, v/v），0.15 mL/min，35 °C，总运行约190 min。

3.2 双键位置及顺反异构TG的分离

在选定三柱条件下，sn-OPO（油酸Δ9Z）与sn-VPV（反刍酸vaccenic acid Δ11Z）保留时间差约10 min，双键更靠近酯键保留较低；rac-OOP（Δ9Z顺式）与rac-EEP（反式elaidic acid Δ9E）可明显分离，反式异构保留更强（类饱和链增强色散作用）。混合进样时sn-POO与低丰度的sn-VPV共流出（肝中vaccenic酸极少故可指认为sn-POO）。表明Chiralpak IF-3在该条件下可区分双键位置异构及Z/E几何异构。

3.3 串联柱系统性能测试

无残留（空白中未检出TG信号）；在线混合ACN与水较手动配制日间保留更稳定，推荐在线混合。混合大鼠肝样进样，sn-OPO、sn-OOP、sn-POO保留时间日内/日间CV＜0.5％；主要对映体sn-POO对映体百分比日内CV 0.14％、日间CV 0.24％，低丰度sn-OOP对映体百分比日间CV 4.05％（在脂质个体差异大背景下可接受），表明方法重现性良好。

3.4 肝样本立体选择性分析

—结构分辨率增强：选取TG 52:2（m/z 876.8015, 16:0_18:1_18:1）、TG 54:4（m/z 900.8009, 18:0_18:2_18:2）、TG 50:2（m/z 848.7702, 16:0_16:0_18:2）、TG 50:1（m/z 850.7853, 16:0_16:0_18:1）比较C18 RPLC与CSP法。RPLC各为一或两个宽峰，CSP法分出多至9–11个峰，可区分sn-POO/sn-OOP对映体（大鼠肝以sn-POO为主）及其与位置异构体（如sn-POP）、双键位置异构体的洗脱顺序，并通过MS/MS碎片比（sn-2位裂解能高于sn-1/3位）辅助指认sn位。证实该方法揭示传统RPLC掩盖的TG立体化学多样性。

—阿霉素处理大鼠肝TG立体变化：对照与Dox处理大鼠肝比对，TG 50:2中sn-LPP对映体百分比由7.55％升至21.6％（相对增幅～186％），超出方法对映体百分比日间变异（CV 4.07％）；TG 52:2对映体百分比无明显变化。位置异构百分比显示sn-PLP略降、sn-LPP与sn-OPO相对增加，提示Dox可能影响脂酰转移酶对P/O/L的sn位偏好。虽仅n＝1/组属探索性，但证明该方法可检测生物样本中立体异构分布偏移。

讨论与结论翻译

本研究系统考察了直链淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基卡马酸酯)手性固定相（Chiralpak IF-3）上影响TG位置异构体及对映体分离度的色谱参数（流动相组成、柱温、流速），表明在所有评估条件下对映选择性（α）较低，须通过延长分离路径（三根柱串联）增加理论塔板数以获足够分离度；该法还可区分双键位置及顺式/反式构型TG，超越以往报道的多糖CSP-TG分离维度。方法日间保留时间重复性佳（CV＜0.3％），生物基质中对映体百分比测定稳定。通过在复杂肝提取物中提升TG异构体分辨力，本方法可用于探究肝脏等复杂脂质组的立体化学改变，无需再循环色谱即可区分多种TG立体异构体；但紧密相关的部分位置异构体仍需sn-纯品标准或双键定位策略辅助指认。尽管倍增了检出异构体数，部分异构体（如sn-SLL与TG 16:0_18:0_20:4等）仍未基线分离，超临界流体色谱（Supercritical Fluid Chromatography, SFC）或可借助改善传质缩短分析时间，值得进一步研究。