利用免疫电分析技术对RNA甲基化特征进行多重检测，以解析癌细胞中的致癌点突变

《Talanta》：Immunoelectroanalytical multiplexing of RNA methylation signatures to decode oncogenic point mutations in cancer cells

　　

Víctor Pérez-Ginés|Rebeca M. Torrente-Rodríguez|Raquel Rejas-González|Ana Montero-Calle|María Pedrero|José M. Pingarrón|Rodrigo Barderas|Susana Campuzano

马德里康普顿斯大学化学学院分析化学系，西班牙马德里28040，科学广场2号

摘要

表观基因组学和表转录组学上的改变——尤其是RNA甲基化，如N⁶-甲基腺苷（m6A）、N⁵-甲基胞嘧啶（m5C）、N¹-甲基腺苷（m1A）和N⁷-甲基鸟嘌呤（m7G）——越来越被视作结直肠癌（CRC）及其他高发疾病发病机制中的关键调控因素。尽管这些修饰在临床和生物学领域的重要性日益凸显，但目前仍缺乏能够快速、准确地对这类RNA修饰进行单种（m1A、m7G）或多种同时定量的电化学检测方法。在此，我们提出一种间接竞争型四分析物安培免疫分析法，可同时检测m6A、m5C、m1A和m7G。

与BSA结合的甲基化合成核苷酸通过共价键连接到带羧基的磁性微珠（HOOC-MμBs）上，这些微珠会在目标样本中与游离的甲基化核苷酸竞争有限的抗表观标记检测抗体。随后，通过辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级抗体（Ab2-HRP）进行标记，再在丝网印刷碳电极（SPCEs）上实现安培检测，从而实现单种或多种修饰物的检测。所开发的生物平台具有高度选择性，几乎不存在交叉干扰，且检测时间显著缩短至30分钟，这为其应用于多功能检测体系提供了可能。在CRC细胞实验中，仅需纳克级的总RNA即可区分五种细胞系中的基础状态和通路激活状态，揭示出与不同生物学和遗传背景相关的独特RNA甲基化模式。此外，作为概念验证，该技术还被用于同时检测两种细胞类型——野生型细胞和携带具有临床意义的KRAS G12V突变的细胞——中的四种甲基化修饰，从而评估目标表观标记表达水平与这一致癌突变之间的关联。

引言

结直肠癌（CRC）的发病率极高，且在年轻人中的发病率也在上升，使其成为全球范围内第二大癌症相关死亡原因[1]。尽管已有诸多进展，但依然需要基于精准医疗理念不断优化创新的诊断和预后策略。在CRC研究领域的创新中，那些聚焦于DNA和RNA化学修饰相关的表观基因组学和表转录组学变化的研究，已成为后基因组时代生命科学领域的热点，因为它们在多种疾病的发病机制中起着关键作用。这类化学修饰是可逆的，能够让细胞快速调整基因表达以应对各种刺激，进而影响发育、细胞分化、免疫反应以及肿瘤进展等过程[2,3]。具体而言，表转录组学的RNA修饰会影响细胞的代谢，参与多种生物学过程，包括这些分子的功能、完整性、代谢以及生物合成。在目前已发现的170多种RNA修饰中，存在于各类调控性和功能性RNA（转运RNA、核糖体RNA、小核RNA、信使RNA以及长非编码RNA）中的鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶的甲基化修饰，如N⁷-甲基鸟嘌呤（m7G）、N¹-甲基腺苷（m1A）、N⁶-甲基腺苷（m6A）和N⁵-甲基胞嘧啶（m5C），是与CRC相关的最受研究的化学修饰[4]。

在这些RNA修饰中，腺嘌呤N6位的甲基化（m6A）在大多数真核生物以及某些病毒中都存在，由于其能在癌症的发生和发展过程中发挥调控作用，尤其是对与转移相关的基因表达的调控作用，因此格外重要[[5], [6], [7]]。m6A与多种癌症类型有关[5]，而在大多数CRC肿瘤中，其对应的甲基化酶表达过度，这种高表达水平往往与更差的预后相关[8]。因此，这种化学修饰有望成为癌症早期诊断的潜在靶点，也为个性化治疗提供新的思路。

m5C是一种被广泛研究的表观标记，其在不同真核生物基因组中的含量各不相同。在人类中，5-甲基胞嘧啶主要存在于CpG二核苷酸上，而这些区域与发育、衰老以及疾病进展密切相关。异常的m5C模式会通过影响细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及化疗耐药性来促进癌症发生[9]，同时还会稳定致癌信使RNA并增强其翻译效率，还会抑制机体的先天免疫反应[10]。因此，m5C及其调控机制的紊乱与不良预后之间存在关联[11]。在CRC中，m5C在恶性转化和肿瘤进展过程中起着核心作用，是一种重要的表观标记，对其开展系统性的调控分析有助于推动精准医疗的发展[9]。

m1A和m7G的普遍程度较低，目前关于其在癌症中的功能和临床应用的证据也较为有限。不过，随着新方法的出现，使得这类修饰的检测具备了所需的高灵敏度和高选择性，它们作为CRC生物标志物的应用前景逐渐显现。m1A是腺嘌呤N1位的可逆甲基化修饰，会影响碱基配对、逆转录以及蛋白质翻译，已被发现与早期恶性病变及CRC进展有关[12]。它可通过多种信号通路促进肿瘤的生长、侵袭和转移，对癌症的诊断和治疗具有重要意义[13,14]。m7G则是鸟嘌呤N7位的甲基化修饰，它能增强RNA的稳定性，同时调控RNA的加工和代谢过程[15,16]。作为最常见的mRNA帽修饰，m7G会促进肿瘤的迁移、化疗耐药性以及免疫逃逸，有望成为CRC的预后生物标志物和潜在治疗靶点[16,17]。

近期研究显示，CRC患者体内的表观遗传修饰水平存在差异，根据样本类型、检测方法以及研究群体的不同，这些修饰水平既有下降趋势也有上升趋势[10,[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]]。这些差异反映了肿瘤的异质性，也凸显出当前检测标准化方面存在的局限性，因此亟需更精确的分析方法来明确这些表观标记的功能，从而实现其可靠的临床应用。在这一背景下，基于电化学的生物传感技术因其高灵敏度、响应速度快、易于微型化以及具备多重检测能力等优点，有望成为准确检测表转录组学RNA修饰的重要工具，为将相关基础研究成果转化为实际的诊断和临床应用提供可行路径[27]。需要指出的是，目前所报道的电化学检测方法仅能用于检测最常被研究的几种表观基因组和表转录组学标记——5mC、5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、m6A以及N⁶-甲基脱氧腺苷（6mA）[18,20,27]，最近还有研究开始尝试检测与DNA甲基化-去甲基化循环相关的四种甲基化标记[28]。然而，目前尚未有电分析方法能够检测那些虽然出现频率较低，但在生物学上却具有重要意义的RNA修饰，比如1-甲基腺苷（m1A）和7-甲基鸟嘌呤（m7G）。

虽然这些化学修饰通常作为独立的生物标志物被研究，但随着人们对它们之间相互关联作用的了解日益深入，人们开始倾向于使用能够同时检测其绝对含量和相对含量的方法，从而建立更强的关联关系[29,30]。事实上，Wei等人最近就整合了m6A/m5C/m1A/m7G这几种RNA修饰在CRC诊断中的预后价值进行了研究[31]，他们利用101种机器学习算法构建并验证了用于预测患者生存率的RNA甲基化特征组合，为个性化治疗提供了依据。为了弥补现有检测方法在常见RNA表观标记检测方面的不足，同时覆盖那些尚未得到充分研究的标记，我们开发了一种多功能电化学平台，能够快速、灵敏地同时检测CRC细胞系模型中的m6A、m5C、m1A和m7G。该平台采用间接竞争型免疫分析法，利用带羧基的磁性微珠（HOOC-MμBs），让游离的甲基化核苷酸与BSA结合的甲基化核苷酸竞争有限的检测抗体结合位点。信号的产生则通过辣根过氧化物酶标记的二级抗体（Ab2-HRP）以及安培检测来实现，之所以选择安培检测，是因为它兼具操作简单和检测灵敏度高的优点，因此也被认为是最有可能从学术研究走向实际应用的电化学检测技术[32]。该方法与以往基于蛋白G功能化的MμBs的直接竞争型检测方法有所不同[18,20,27,28]，通过创新的电化学检测方式，能够区分来自CRC细胞的总RNA中m6A、m5C、m1A和m7A的基础状态与激活状态，包括对照组、野生型细胞系以及突变型细胞系。

章节节选

仪器设备

在微珠功能化实验中，我们使用了微管振荡培养箱（AccuTherm 1-4002-HCS，Labnet）、DynaMag-2型磁珠浓缩器（产品编号：12321D，Invitrogen?Thermo Fisher Scientific）、涡旋混合器（Velp Scientifica）以及磁力搅拌器（Inbea）。此外，我们还使用了自制的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）外壳，以及从AIMAN GZ和Methrom-Dropsens S.L.购买的含有1个或8个钕制圆柱形磁铁的特氟龙材质商用装置。

结果与讨论

我们所开发的生物平台基于一种间接竞争型的四元素同时检测免疫分析架构，该架构已经针对每种单独的表观修饰核苷酸（m7G、m1A、m6A和m5C）进行了全面优化，之后又被整合到一个多功能检测平台上，用于样本分析，旨在将其应用于临床现场检测。该平台的核心是表面带有羧基的商用磁性微珠（HOOC-MμBs），这些微珠通过共价键

结论

我们首次实现了能够检测与细胞层面致癌点突变相关的表转录组学改变的电化学生物传感平台。我们所设计的电化学检测方法基于间接竞争型免疫分析，采用了市售的磁性微珠和丝网印刷碳电极，能够实现四种RNA甲基化标记（m6A、m5C、m1A和m7G）的单种及多种同时检测。通过对关键参数的精心优化，确保了检测的

CRediT作者贡献说明

Víctor Pérez-Ginés：数据整理、实验研究、方法设计、初稿撰写、论文审阅与修改。Rebeca M. Torrente-Rodríguez：数据整理、资金筹集、项目管理、实验指导、初稿撰写、论文审阅与修改。Raquel Rejas-González：实验研究、论文审阅与修改。Ana Montero-Calle：数据整理、实验研究、论文审阅与修改。María Pedrero：实验指导、初稿撰写、论文审阅与修改。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢以下机构及个人的支持：由MCIN/AEI/10.13039/501100011033资助的PID2022-136351OB-I00和PID2022-140307OB-I00项目，以及“ERDF A way of making Europe”项目对S.C.和R.B.提供的支持；AES-ISCIII计划为R.B.提供的PI20CIII/00019和PI23CIII/00027项目资助；由马德里自治区和UCM在第六期PRICIT计划（2022–2025年）框架下为R.M.T.-R.提供的PR17/24-31891项目（ElectroCircSens项目）。V.P.G.还感谢康普顿斯大学提供的博士后资助。