应用利巴韦林喷雾清除鼻腔共生病毒治疗过敏性鼻炎的研究

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Therapy of allergic rhinitis using ribavirin spray to clear nasal commensal viruses

　　

摘要：既往研究广泛关注共生细菌在健康与疾病中的作用，而共生病毒的作用大多未被探索。尽管肠道等器官的共生病毒被报道可维持组织稳态，但其是否参与鼻部生理或病理过程（鼻是直接接触外界环境的器官）尚不清楚。本研究聚焦鼻腔共生病毒在过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)发病中的作用——AR是影响全球20%~30%人口的健康问题，发现使用利巴韦林清除鼻腔共生病毒可缓解AR症状，提示这些病毒参与AR发病机制。机制上，鼻腔共生病毒被固有免疫感受器识别后启动I型干扰素(type I interferon, IFN-I)产生，招募并产生一群IFN诱导的中性粒细胞，其释放中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)促进AR进展。最重要的是，为验证清除鼻腔共生病毒能否临床治疗AR患者，研究人员开展了随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验（中国临床试验注册中心标识符：ChiCTR2400082642），探究利巴韦林喷雾治疗AR的疗效与安全性，发现利巴韦林组患者鼻腔共生病毒显著减少、症状较安慰剂组明显缓解，证实利巴韦林喷雾的治疗有效性。因此，本研究提出了AR的新发病机制及AR患者的新治疗思路。

论文解读：应用利巴韦林喷雾清除鼻腔共生病毒治疗过敏性鼻炎的研究

过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)为全球高发上呼吸道过敏性疾病，影响20%~30%人群，典型症状包括鼻塞、鼻痒、流涕及打喷嚏，严重者影响生活质量、睡眠及工作效能。经典病理机制为过敏原特异性Th2介导的II型免疫反应、IgE产生及嗜酸性粒细胞浸润致鼻黏膜炎症、血管通透性增加及黏液分泌增多。现有主流治疗为鼻用糖皮质激素喷雾或口服抗组胺药，属对症控制急性发作，疗效持久性差且长期用药存在副作用顾虑；特异性过敏原免疫治疗疗程长达2~3年、操作复杂、依从性低且长期疗效不确定；抗IgE或抗II型细胞因子（如奥马珠单抗、度普利尤单抗、美泊利珠单抗等）生物制剂需注射、疗程长且价格昂贵，临床应用受限。另一方面，鼻腔微生物群（尤共生细菌）与AR关系已有报道，但鼻腔共生病毒(commensal viruses)在AR发生发展中的作用几无研究。鉴于其他部位（如肠道）共生病毒可通过模式识别受体信号调控组织稳态或易感炎症性疾病，本研究假设鼻腔共生病毒参与AR病理过程，并通过动物实验与随机双盲安慰剂对照II期临床试验(R-STAR研究, ChiCTR2400082642)，探究清除鼻腔共生病毒（使用广谱抗病毒药利巴韦林喷雾）对AR的治疗作用及分子机制。该论文发表于Signal Transduction and Targeted Therapy。

主要关键技术方法

研究使用卵清蛋白(OVA)及尘螨(HDM)诱导C57BL/6J小鼠AR模型，通过鼻滴利巴韦林或法匹拉韦(favipiravir)降低鼻腔共生病毒，并进行病毒重引入回补实验；采用Irf3^?/?、Ifnar1^?/?、Rig-I(Ddx58)^?/?、Tlr3^?/?、Cgas^?/?、Sting^?/?基因敲除小鼠验证通路；对鼻黏膜CD45⁺细胞行单细胞RNA测序(scRNA-seq)；通过流式细胞术分析免疫细胞亚群；检测鼻灌洗液(nasal lavage fluid, NLF)中细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13、IFN-α、IFN-β等)及瓜氨酸化组蛋白H3(Cit-H3, NETs标志物)；使用NETs清除剂(GW-311616、DNase I)干预；对小鼠及人鼻腔样本行宏转录组(metatranscriptomic)测序分析病毒组(virome)；临床部分纳入42例中重度持续性AR患者（安慰剂组n=20，利巴韦林喷雾组n=22），治疗4周并以总鼻症状评分(total nasal symptom score, TNSS)为主要终点，视觉模拟量表(VAS)、鼻炎控制评估测试(RCAT)为次要终点，1年随访评估长期效应。

研究结果

Reduction of nasal commensal viruses using ribavirin alleviates AR symptoms（使用利巴韦林减少鼻腔共生病毒减轻AR症状）

小鼠鼻腔存在真核病毒及噬菌体组成的共生病毒组，每日鼻滴利巴韦林(3 mg/kg)一周可显著降低其丰度且不影响共生细菌组成。OVA或HDM诱导AR模型中，利巴韦林处理组AR小鼠搔抓及打喷嚏频次减少，鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润减轻，NLF中IL-4、IL-5、IL-13及I型IFN水平下降，血清OVA/HDM特异性IgE降低，鼻黏膜病理损伤减轻，鼻黏膜招募的中性粒细胞数显著减少。将对照组NLF回输至利巴韦林预处理小鼠可重建鼻腔共生病毒并使AR症状及II型细胞因子回升；另一广谱抗病毒药法匹拉韦亦能减轻AR症状及II型细胞因子。表明鼻腔共生病毒促进AR发展，鼻用利巴韦林清除之可缓解AR症状，可能与减少中性粒细胞招募有关。

Reduction of nasal commensal viruses suppresses ISG^hineutrophil subsets（减少鼻腔共生病毒抑制ISG^hi中性粒细胞亚群）

scRNA-seq将鼻黏膜中性粒细胞分为Cd14^hi(N01–N03)、Siglecf^hi(N04)及Ngp^hi(N05)亚群。AR小鼠中Cd14^hi亚群显著增加，利巴韦林处理后减少。Cd14^hi亚群高表达IFN刺激基因(ISGs)及中性粒细胞脱颗粒、IFN信号、髓系招募相关基因，定义为ISG^hi中性粒细胞。流式证实AR小鼠鼻黏膜CD14^hiISG^hi中性粒细胞增多，利巴韦林处理后受抑；骨髓中性粒细胞比例及ISG表达不受利巴韦林直接影响。提示清除鼻腔共生病毒通过抑制ISG^hi中性粒细胞鼻黏膜招募减轻AR。

Nasal commensal viruses initiate IFN production to generate ISG^hineutrophils and aggravate AR symptoms（鼻腔共生病毒启动IFN产生以生成ISG^hi中性粒细胞并加重AR症状）

Irf3^?/?及Ifnar1^?/?小鼠AR症状、鼻黏膜病理、细胞因子及CD14^hi中性粒细胞浸润均减轻，利巴韦林在Ifnar1^?/?小鼠中无额外改善；Rig-I^?/?、Tlr3^?/?、Cgas^?/?、Sting^?/?小鼠同样症状减轻、CD14^hi中性粒细胞减少；外源性鼻滴IFN-α1b加重AR症状、病理、II型细胞因子及CD14^hi中性粒细胞，利巴韦林不能逆转IFN-α1b加重效应。表明鼻腔共生病毒经RIG-I/TLR3/cGAS-STING-IRF3轴诱导I型IFN产生，招募并生成ISG^hi中性粒细胞从而促进AR。

IFN promotes neutrophil extracellular traps to aggravate AR symptoms（IFN促进中性粒细胞胞外诱捕网形成加重AR症状）

AR小鼠鼻黏膜及NLF中存在NETs（MPO与Cit-H3共定位），利巴韦林处理后NETs减少，病毒重引入可恢复。NETs清除剂(GW-311616、DNase I)显著降低鼻黏膜NETs并减轻AR症状、病理及II型细胞因子。体外IFN-α1b可诱导骨髓中性粒细胞形成NETs（Cit-H3及MPO升高），不被利巴韦林影响；Ifnar1^?/?小鼠鼻黏膜NETs减少，外源IFN-α1b可增加野生型但不变Ifnar1^?/?小鼠NETs。表明鼻腔共生病毒→I型IFN→ISG^hi中性粒细胞→NETs释放→加重AR。

Ribavirin spray for the treatment of AR patients: a randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 2 clinical trial（利巴韦林喷雾治疗AR患者的随机双盲安慰剂对照II期临床试验）

42例AR患者随机接受安慰剂或利巴韦林喷雾（12 mg/d，每侧鼻孔1喷，bid×4周）。ITT及PP人群分析显示：安慰剂组TNSS无显著变化，利巴韦林组治疗后第1、2、4周TNSS均较基线显著下降(p<0.001)，且第2、4周显著低于同期安慰剂组(p=0.041、p=0.035)；ANCOVA显示4周TNSS组间差异具统计学意义（均差–2.54, 95%CI –4.31~–0.77, p=0.006）。VAS评分利巴韦林组显著降低，RCAT评分显著升高。尘螨致敏亚组同样显示利巴韦林组症状显著改善。安全性分析未见血尿常规、肝肾功能显著改变，无≥3级不良事件、严重不良事件(SAE)或药物不良反应。NLF中Th2及Th17相关细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A)及IFN-α、IFN-β治疗后利巴韦林组较安慰剂组下降，Cit-H3水平下降，且与基线病毒载量变化一致。表明利巴韦林喷雾有效降低鼻腔共生病毒并安全缓解AR症状。

AR patients with high nasal commensal viruses and severe symptoms are more suitable for Ribavirin spray therapy（鼻腔共生病毒高载量及症状重的AR患者更适用利巴韦林喷雾治疗）

AR患者鼻拭子宏转录组示鼻腔共生病毒丰度高于健康对照，且与基线TNSS及ISGs表达正相关。以中位病毒丰度为界，高病毒载量患者利巴韦林疗效优于低病毒载量者；以基线TNSS中位值9为界，TNSS≥9患者利巴韦林疗效优于TNSS<9者。治疗后利巴韦林组（非安慰剂组）鼻腔共生病毒丰度显著下降。提示利巴韦林喷雾尤其适用于鼻腔共生病毒高及中重度AR患者。

1-year follow-up of the subjects of R-STAR study（R-STAR研究受试者1年随访）

PP人群治疗结束后1年随访：利巴韦林组反射性TNSS显著低于安慰剂组(p=0.039)；80%利巴韦林组患者用药频次较治疗前1年减少（安慰剂组低，p=0.008），总用药频次（尤其鼻用激素及抗组胺药）显著低于安慰剂组(p=0.007)，提示利巴韦林喷雾具长期效益。

The potential nasal commensal virus species contribute to human AR（潜在致病人类AR的鼻腔共生病毒种类）

AR患者鼻病毒组中Betaretrovirus（β逆转录病毒属）丰度高于健康人且利巴韦林治疗后下降；该属内enzootic nasal tumor virus 2(ENTV-2)及bovine retrovirus CH15(BoRV CH15)在AR患者中升高且利巴韦林治疗后下降，高ENTV-2或BoRV CH15丰度患者对利巴韦林反应更佳，提示二者可能参与人类AR发病。

讨论与结论

研究人员总结：AR发展中，鼻腔共生病毒被固有免疫感受器识别启动鼻黏膜I型IFN产生，诱导ISG^hi中性粒细胞招募及NETs释放从而加重AR症状；鼻用广谱抗病毒药利巴韦林清除鼻腔共生病毒可缓解AR，R-STAR II期临床试验证明利巴韦林喷雾有效且安全降低鼻腔共生病毒并改善AR患者症状，为这一高发病率疾病提供新治疗方向。研究指出I型IFN在病毒–AR轴中关键作用，但共生病毒诱导IFN水平远低于致病性病毒感染，其与过敏性疾病的量效关系待进一步阐明；NETs判定以MPO/Cit-H3共定位为基础，需更明确形态学验证。利巴韦林具潜在血液及致畸毒性，本试验局部喷雾未观察到相关不良反应，未来需开发更安全鼻用专用广谱抗病毒制剂；II期结果需多中心III期试验在不同人群、过敏原谱及与现有疗法对比中验证。研究同时纳入季节性与常年性AR患者，但花粉致敏季节性AR比例偏低需在III期扩充；不能排除利巴韦林通过减少噬菌体间接影响细菌群落参与AR；停药后病毒可能再定植，鼻腔病毒组重塑及特定病毒株利弊需深究。ENTV-2及BoRV CH15为人畜相关逆转录病毒，未见人类感染报道，其因果关联需活病毒实验进一步确认。综上，鼻腔共生病毒通过I型IFN–ISG^hi中性粒细胞–NETs轴促进AR，利巴韦林喷雾清除鼻腔共生病毒是AR潜在新型病因学治疗手段。