阿片受体（Opioid Receptors）变构调节（Allosteric Modulation）的分子机制

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Molecular mechanism of allosteric modulation of opioid receptors

　　

阿片类镇痛药（Opioid Analgesics）虽能提供强效镇痛作用，但受限于严重不良反应、耐受性及个体间遗传变异导致的响应差异。多药理学（Poly-pharmacology）与阿片受体的变构调节为在缓解上述局限的同时提升镇痛效果提供了有前景的策略。泛正向变构调节剂（Pan-Positive Allosteric Modulators, pan-PAMs）可同时增强多种阿片受体亚型的活性，整合了两者的优势，代表着疼痛管理领域新兴的治疗范式。然而，pan-PAM在阿片受体发挥作用的分子机制仍不甚明了。研究人员对BMS-986187作为阿片受体pan-PAM的特性进行了表征，并报道了多种阿片受体亚型与该调节剂结合的冷冻电子显微镜（Cryo-Electron Microscopy, cryo-EM）结构，揭示了一个此前未被识别的变构口袋。结构与功能分析揭示了介导阿片受体家族PAM识别的保守结合基序，并阐明了阿片受体关键残基对BMS-986187变构调节的重要贡献。功能上，BMS-986187通过阿片节约效应（Opioid-Sparing Effect）增强镇痛效果，允许使用更低剂量的阿片类药物从而减少副作用，同时恢复功能丧失（Loss-of-Function, LOF）μ-阿片受体（μOR）变异体的活性。这些发现定义了阿片受体中此前未被识别的变构位点，并为通过变构调节合理设计更安全、更有效的阿片类药物建立了结构框架。

阿片类镇痛药（Opioid Analgesics）在疼痛管理中仍属于药效最强的药理学选择之一，但其临床应用受限于成瘾、呼吸抑制、耐受性等不良反应，以及由遗传变异驱动的显著个体间差异。传统阿片类药物如吗啡（Morphine）和芬太尼（Fentanyl）通过作为μ-阿片受体（μ-Opioid Receptor, μOR）的高效正构激动剂（Orthosteric Agonists）发挥镇痛效应，但其直接且持续的μOR激活同时触发了镇痛通路和介导不良反应的回路，包括脑干呼吸中枢和边缘奖赏系统，使得治疗获益与有害效应的分离本质上难以实现。此外，疼痛尤其是慢性疼痛作为多维度、多因素疾病的认知日益加深，凸显了单一靶点疼痛管理策略的局限性。为克服这些挑战，多药理学因其在复杂病因疾病中的已验证获益及多种多靶点药物的成功获批，已成为疼痛缓解的有前景选择。除μOR外，阿片受体家族还包括δ-阿片受体（δ-Opioid Receptor, δOR）和κ-阿片受体（κ-Opioid Receptor, κOR），均参与疼痛调节。临床已批准的替扎尼定、他喷他多和美沙酮等药物 exemplify了这一策略：将中度μOR激活与单胺再摄取抑制、NMDA受体（N-Methyl-D-Aspartate Receptor）调节或其他阿片受体亚型作用等额外机制相结合。已进入多项III期临床 trial 的首创类药μOR/孤啡肽（Nociceptin/Orphanin FQ Peptide, NOP）受体激动剂Cbranopadol旨在提供强效镇痛，同时潜在降低呼吸抑制、耐受性和滥用倾向。然而，持续激活阿片受体带来的风险包括耐受性和受体脱敏。

与正构激动剂不同，变构调节剂（Allosteric Modulators）作用于拓扑学上不同的结合位点，在多个G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor, GPCR）系统中已展现出独特的药理学优势。变构调节剂分为负向变构调节剂（Negative Allosteric Modulators, NAMs）与正向变构调节剂（Positive Allosteric Modulators, PAMs），其中NAMs如钠离子抑制受体信号，而PAMs增强受体活性。PAMs在对手的多种理论优势包括选择性放大内源性阿片肽的作用、协同增强外源性阿片类药物效应以实现剂量降低，以及在正构位点突变损害经典配体活性时保留或恢复镇痛效果。Pan-PAMs作为PAMs的一个亚类，可同时增强多种阿片受体亚型的活性，通过微妙提升受体家族的内源性阿片张力，可能强化抗伤害感受通路并减少中枢敏化，而不诱导超生理性受体激活，从而具有实现强效镇痛同时最小化呼吸抑制、耐受性和成瘾倾向的潜力。

研究人员系统比较了BMS-986187和BMS-986122两种变构调节剂对三种阿片受体及不同下游信号通路的效应。采用基于生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET）的Gαi1-Gγ2解离实验和β-arrestin2招募实验，研究人员发现BMS-986187对三种阿片受体的G_i蛋白信号通路和β-arrestin2招募通路均表现出正向功能协同性（logαβ > 0），具有中等到高的表观亲和力（pKB 4.98-7.80），而BMS-986122主要对μOR具有变构增强效应。探针依赖性实验显示，同一激动剂在Gαi1-Gγ2解离实验中的功能协同性 consistently高于β-arrestin2招募实验。BMS-986187在G_i蛋白信号通路中对三种受体均表现内在激动剂活性，但在β-arrestin2通路中仅选择性促进δOR的招募，而BMS-986122的内在激动剂活性较弱。

为阐明BMS-986187的结合模式，研究人员利用感染访虫（Sf9）细胞表达系统，采用NanoBiT拴系策略增强复合物稳定性，通过cryo-EM解析了美沙酮/μOR-G_i1（3.04 ?）、阿西马多林/κOR-G_i1（2.58 ?）、亮氨酸脑啡肽/δOR-G_i2（3.05 ?）以及无正构激动剂的BMS-986187/δOR-G_i2（2.79 ?）四种结构。受体聚焦的局部精细化揭示了位于7次跨膜（7-Transmembrane, 7TM）束外周的额外螺旋特征，分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟进一步确认了BMS-986187的存在。该位点与之前报道的BMS-986122结合位点空间上不同。

结构显示，BMS-986187以倒置T型构象占据由TM2-TM4胞外部分形成的额外螺旋口袋，该位点在拓扑学上不同于BMS-986122接触的TM3-TM5区域，而类似于此前描述的CB₁受体中ZCZ011结合的额外螺旋变构位点。结构比对揭示BMS-986187口袋在阿片受体亚型间保守，尤其围绕其容纳三环黄烯二酮（Tricyclic Xanthenedione）核心的位点。该核心位于Y3.34侧链上方，并与N3.35侧链形成氢键，丙氨酸替代任一残基均显著降低BMS-986187效力。核心的四甲基基团与L2.52、S4.54及L/I/V4.58发生疏水相互作用。上部2-甲基苯 validated 酚基团插入TM3和TM4之间的裂隙，与K3.26、I3.27（δOR中为A3.27）、S3.30、I3.31及M4.61（κOR中为I4.61）建立疏水接触。K3.26的替换显著削弱激活效力，而I3.31A突变增强BMS-986187介导的受体激活。这些发现鉴定了保守的K3.26-I3.31-Y3.34-N3.35基序作为pan-PAM结合和活性的关键结构决定因素。

序列分析还揭示了可能调节亚型偏好的非保守残基。A3.27I突变降低δOR的G_i信号，而I3.27A在κOR和μOR中增强活性；M4.61I/A突变在δOR和μOR中降低激活，而I3.27A/I4.61M双突变在κOR中增加激活。这些观察与先前证据一致，即苯环邻位甲基取代增加δOR PAM选择性，表明2-甲基苯基基团作为亚型选择器，3.27-4.61裂隙的相互作用在决定亚型特异性调节中起主导作用。

BMS-986187的内在激动剂活性方面，在G_i蛋白信号通路中受体激活顺序为δOR > μOR ≈ κOR，几乎完全激活δOR，而在β-arrestin2通路中选择性作用于δOR。与无活性的δOR结构（PDB: 4N6H）比较，BMS-986187结合的δOR采取完全活性构象，TM6胞内区向外位移约13 ?。在变构位点，Y130^3.34侧链旋转约120°以通过π-π堆积容纳三环黄烯二酮核心，N131^3.35侧链向外旋转约110°，与三环黄烯二酮支架的羰基形成氢键。N131^3.35的替换显著损害BMS-986187对δOR的激活，突显该残基在变构口袋向激活核心传递内在效应中的关键作用。值得注意的是，纳曲酮（Naltrexone）不能抑制BMS-986187介导的激动作用，提示其激活机制与经典阿片激动剂不同。

在BMS-986187的PAM效应机制方面，与美沙酮结合的μOR结构比较，变构口袋内仅观察到K143^3.26、I148^3.31和M205^4.61的细微侧链重排。结构分析显示W194^4.50发生显著的旋转异构变化（115.7°），该突变增强PAM效应和内在激动剂活性，可能由于W4.50作为A类GPCR中胆固醇接触残基，其旋转或替换缓解空间约束以更好容纳BMS-986187。正构结合位点处，Q126^2.60采取替代构象与D149^3.32形成氢键。

丙氨酸扫描突变分析进一步识别PAM活性的关键残基。N152^3.35替换为Ala、Asp或Gln几乎完全消除BMS-986187的PAM活性，表明该残基在介导内在效应和正向变构调节中均发挥关键作用。N152^3.35位于保守的钠离子结合口袋内，该位点已知作为阿片受体活性的NAM。钠离子与BMS-986187竞争性结合N3.35。功能实验表明，200 mM钠离子显著削弱、400 mM完全 abolish BMS-986187的内在激动剂活性，但在400 mM钠离子下仍能引起美沙酮浓度-反应曲线的左移，显示残余PAM效应，且这种相互作用存在受体亚型依赖性。

在体内实验中，研究人员采用52°C热板实验和尾部夹痛实验评估急性热痛和机械痛。芬太尼的ED₅₀分别为0.19 μmol/kg和0.32 μmol/kg，BMS-986187（10 mg/kg）预处理使ED₅₀分别降至0.10 μmol/kg和0.12 μmol/kg。BMS-986187单独无镇痛作用，也不改变芬太尼作用持续时间。同样，BMS-986187增强美沙酮的镇痛活性，尾部夹痛实验中ED₅₀从15.58 μmol/kg降至11.98 μmol/kg。在副作用方面，芬太尼和美沙酮在ED₅₀剂量下显著抑制胃肠（Gastrointestinal, GI）转运导致便秘，并诱导与多巴胺激活和奖赏相关行为关联的高运动活性。同等剂量阿片类药物与BMS-986187合用不加重GI功能抑制和高运动活性；而在等效镇痛剂量下，PAM诱导的阿片节约效应减少了GI抑制和高运动活性，证明BMS-986187通过阿片节约机制增强阿片镇痛同时减轻主要副作用。

药代动力学研究显示，10 mg/kg皮下注射后BMS-986187可快速吸收（T_max: 0.2±0.1 h）且半衰期适当（t_1/2: 3.6±0.4 h），但系统暴露有限（AUC_0-t: 66300±4793 h·ng/L），可能归因于其较差的水溶性。基于结构和功能洞察，研究人员进行了合理修饰：区域I中将四甲基替换为环丁基（1-1）、环戊基（1-2）或苯基（1-3），其中1-1中度改善μOR PAM活性，1-2效力相当，1-3因空间位阻丧失效应；去除四甲基并引入极性氧原子得到化合物1-4，PAM活性轻微增强，cLogP显著降低（3.39），配体亲脂性效率（Ligand Lipophilicity Efficiency, LLE）改善。区域II优化中，较小或疏水性较低的取代基丧失PAM活性，而增加取代基体积和疏水性恢复活性；卤素原子引入中央苯环改善膜渗透性，氟代或氯代类似物（2-5至2-8）保留强PAM效应，氟取代优于氯取代。化合物1-4和2-6显示增强的PAM效力和改善的物理化学性质，成为进一步开发的有前景先导物。

对于μOR遗传变异的功能恢复，研究人员分析了GPCR数据库中27个变异，优先选择跨膜段和胞外环中對激活和偶联关键的替换。结果显示56%变异（15/27）对芬太尼显示LOF，近两倍于吗啡（30%）。BMS-986187 robustly恢复了芬太尼损害变异的信号，即使其自身内在激动剂活性丧失，近完全挽救6个LOF变异并显著改善多个变异的效力或效能，但對吗啡响应的恢复有限。

讨论部分，研究人员指出传统阿片类药物和新出现的硝基苯并咪唑类合成阿片类药物加剧了全球阿片类药物滥用和过量死亡，凸显了具有新型作用机制的调节剂的迫切需求。NIDA认定为优先方向的变构调节剂呈现出具有更优安全性特征的替代选择，而多药理学通过同时调节多种阿片受体亚型成为增强镇痛效果同时减轻副作用的重要方法。研究人员首次报道了此前未被识别的阿片受体家族泛变构调节机制和药理学范式。

与大多数选择性靶向单一受体亚型的经典GPCR变构调节剂不同，BMS-986187作为ago-pan-PAM作用于参与镇痛的三種阿片受体。尽管此前药理学和计算研究推测BMS-986187可能与μOR选择性调节剂BMS-986122共享位点或占据TM1-TM2-TM7腔，cryo-EM分析揭示其结合于独特的TM2-TM3-TM4脂质面向口袋，与保守的K3.26-I3.31-Y3.34-N3.35基序形成关键相互作用。3.27和4.61位的亚型特异性残基微调受体选择性。这些保守和 divergent 位点为合理设计变构调节剂提供了结构指导。

机制上，BMS-986187与钠结合位点建立直接相互作用，驱动N3.35重定向并瓦解钠配位网络，这一机制在其他GPCR变构复合物中未被报道。BMS-986122也被证明通过扰动钠结合位点发挥其变构效应，但並不直接與該位點相互作用。考虑到钠结合口袋在A类GPCR中高度保守，其直接或间质调节可能代表了一种潜在普适的正向变构调节机制。同时 engagement 变构位点和钠位点可能同样赋予信号偏倚，BMS-986187选择性激活μOR、κOR和δOR的G_i信号，但仅弱激活δOR的β-arrestin信号。阿片受体的偏倚信号具有重要安全性意义：μOR G蛋白偏倚激动剂与减少呼吸抑制和便秘相关，κOR偏倚配体可能减轻烦躁和致幻效应，而δOR的β-arrestin信号与惊厥、GI运动减少和镇痛耐受等不良结局相关。BMS-986norepinephrine weak β-arrestin engagement可能代表有利的安全性特征。

体内实验中，BMS-986187显著增强外源性阿片类药物的镇痛效力同时减少便秘和高运动活性等副作用，可能归因于协调的多受体调节使协同镇痛、允许更低阿片剂量、以及不同阿片受体亚型间不良反应信号的功能平衡。BMS-986187单独不表现显著镇痛活性可能由于其相对较低内在激动剂效能。基于结构洞察的初步优化为理性变构药物设计提供了概念验证。遗传变异分析显示BMS-986187恢复了芬太尼损害的大多数变异信号，证明变构调节剂可作为针对个体遗传谱的精准药理学工具，用于患者特异性疼痛管理及纠正致病性GPCR突变导致的功能障碍。