抗CD98hc（CD98 heavy chain，SLC3A2）抗体–药物偶联物（ADC）在卵巢癌中强效抗肿瘤活性的临床前研究

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Potent anti-tumor activity of CD98hc-targeted antibody-drug conjugates in ovarian cancer

　　

摘要：卵巢癌（Ovarian cancer，OC）仍是具有较高复发率且长期疗效有限的难治性恶性肿瘤。抗体–药物偶联物（Antibody–Drug Conjugate，ADC）是一类可将强效细胞毒药物选择性递送至肿瘤细胞的极具前景的治疗制剂。本研究探讨跨膜糖蛋白CD98重链（CD98 heavy chain，CD98hc，由SLC3A2基因编码，参与氨基酸转运及细胞信号转导）作为卵巢癌ADC新型靶点的潜力。蛋白质免疫印迹（Western blotting）与免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）分析显示，卵巢肿瘤组织中CD98hc的表达高于正常卵巢组织。流式细胞术与免疫荧光研究证实，靶向CD98hc胞外域的抗体可结合细胞表面CD98hc并内化至溶酶体。研究人员利用该抗体制备了分别偶联DM1、MMAF（Monomethyl auristatin F）或DXd（Deruxtecan）细胞毒载荷的ADC。其中，抗CD98hc–MMAF构建体在卵巢癌细胞系中表现出最优的细胞毒性，IC50值达皮摩尔（pM）水平。抗CD98hc–MMAF亦能有效抑制卵巢癌患者腹水来源肿瘤细胞系的增殖。机制研究表明，抗CD98hc–MMAF诱导G2/M期细胞周期阻滞、纺锤体微管破坏及凋亡性细胞死亡。体内实验中，人源化抗CD98hc–MMAF ADC显著抑制异种移植小鼠的肿瘤生长及腹膜种植转移，且未观察到明显毒性。上述结果验证了CD98hc作为卵巢癌ADC治疗可行靶点，并支持抗CD98hc–MMAF的临床开发。

论文解读：抗CD98hc抗体–药物偶联物（ADC）在卵巢癌中的抗肿瘤作用及临床前验证

本研究发表于Signal Transduction and Targeted Therapy。卵巢癌尤其是高级别浆液性卵巢癌（High-Grade Serous Ovarian Carcinoma，HGSOC）确诊时多已晚期，标准含铂化疗初始缓解率高但约75%患者最终复发并产生耐药，现有PARP抑制剂（Poly ADP-ribose Polymerase inhibitor，PARPi）及贝伐珠单抗（Bevacizumab）获益人群有限，免疫检查点抑制剂响应率低。已获批用于铂耐药卵巢癌的叶酸受体α（Folate Receptor α，FRα）靶向ADC——Mirvetuximab Soravtansine也存在FRα表达异质性限制。CD98重链（CD98 heavy chain，CD98hc / SLC3A2）是参与氨基酸转运（与LAT1等轻链形成复合物）及整合素信号转导的跨膜糖蛋白，既往报道其在多种肿瘤高表达且与不良预后相关，但其在卵巢癌中作为ADC靶点的系统性临床前评价尚属空白。本研究旨在验证CD98hc在卵巢癌组织及腹水中的表达特征、抗CD98hc抗体介导的内化能力，筛选最优载荷构建ADC，并在细胞、原代腹水细胞及皮下/原位小鼠模型中评估其药效、机制及安全性，为CD98hc靶向ADC的临床转化提供依据。

主要关键技术方法：

研究人员收集42例人卵巢组织标本（6例正常，36例肿瘤）及6例卵巢癌患者腹水原代细胞进行CD98hc表达鉴定（Western blot、IHC、免疫荧光IF）；制备鼠源抗CD98hc胞外域抗体及其偶联三种载荷（DM1、MMAF、DXd）的ADC，并以临床在研人源化抗CD98hc单抗IGN523偶联MMAF用于体内实验；通过流式细胞术检测细胞表面结合与内化（共染LAMP1溶酶体标记），MTT法测细胞活力并计算IC₅₀，细胞周期与Annexin V/PI双染分析周期阻滞与凋亡，Western blot检测周期及凋亡相关蛋白；采用A2780皮下成瘤裸鼠模型（n=6/组，腹腔给药5 mg/kg 每周×3）及OVCAR8荧光素酶标记原位腹腔接种模型（n=6/组）评估抗肿瘤效果，ELISA定量组织中ADC分布，IHC与Western blot检测体内靶标及效应分子。

研究结果

Expression of CD98hc in ovarian cancer

Western blot分析40 μg蛋白提取物显示卵巢癌组织CD98hc（可见不同糖基化条带）表达显著高于配对正常卵巢组织（p=0.0002），各亚型（高级别/低级别浆液性、子宫内膜样）均高于正常。生信数据库（TNMplot、UCSC Xena、Gent2）证实SLC3A2 mRNA在肿瘤及转移灶中高于正常卵巢（p值具显著性）。IHC显示肿瘤细胞膜及胞质强染色而间质弱染；腹水原代细胞（含HGSOC及黏液癌）经PAX8/WT1鉴定后IHC与IF均证实CD98hc定位于细胞膜——结论：CD98hc在卵巢癌原发灶、转移灶及腹水肿瘤细胞中稳定高表达且为膜定位，具备ADC靶点基本条件。

Internalization of anti-CD98hc antibodies

5株卵巢癌细胞系（OVCAR3、OVCAR8、A2780、SKOV3、IGROV1）均表达CD98hc；流式、细胞表面免疫沉淀及活细胞IF证明抗CD98hc^ECTO抗体可结合活细胞表面CD98hc。孵育16 h后膜荧光消失，出现核周斑点状分布并与溶酶体标记LAMP1共定位——结论：抗CD98hc抗体结合膜抗原后可有效内化并转运至溶酶体，满足ADC内吞—释放载荷的机制要求。

Antiproliferative activity of ADCs targeting CD98hc

成功制备DAR（药物抗体比）确定的抗CD98hc–DM1（非裂解接头）、抗CD98hc–DXd与抗CD98hc–MMAF（均为可裂解接头），偶联后重链发生凝胶位移且抗payload抗体可特异识别。三种ADC呈剂量依赖抑制细胞增殖，其中抗CD98hc–MMAF最强，IC₅₀为62–73 pM；未偶联抗体无抑制效应，游离MMAF及同型对照IgG–MMAF无效，CD98hc敲除细胞（HT29/CD98hc^–/–、MDA-MB231/CD98hc^–/–）不受ADC影响——证实杀伤作用CD98hc依赖性。抗CD98hc–MMAF同样抑制6例卵巢癌腹水原代细胞增殖（含铂耐药病例），且在铂耐药细胞系（SKOV3、OVCAR8、OVCAR3）中仍有效。比较实验显示其体外抗增殖活性优于已上市FRα靶向ADC Mirvetuximab Soravtansine——结论：抗CD98hc–MMAF对卵巢癌及化疗耐药细胞具强效、靶点特异性抗增殖活性。

The anti-CD98hc-MMAF ADC induces cell cycle arrest and mitotic catastrophe

5 nM ADC处理1天致细胞变圆；流式细胞术示G2/M期细胞比例升高、G0/G1与S期减少；Western blot示磷酸化Histone H3（Ser10）、磷酸化BUBR1上调，CDK1^Tyr15去磷酸化，Cyclin B积累、Cyclin A下降，Rb^Ser780磷酸化——符合有丝分裂进入特征。IF显示微管纺锤体异常、多极或紊乱；48 h后Annexin V⁺/PI⁺死细胞增多，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP及γH2AX（DNA损伤标记）上调，并可见多核巨细胞——结论：抗CD98hc–MMAF通过微管破坏致G2/M阻滞→纺锤体异常→有丝分裂灾难→凋亡性死亡。

Antitumor in vivo efficacy of anti-CD98hc-MMAF

人源化抗CD98hc（IGN523）–MMAF结合人源CD98hc但不结合鼠CD98hc，排除鼠正常组织on-target干扰。皮下A2780模型：5 mg/kg 每周×3显著抑制肿瘤体积与重量（p<0.05），小鼠体重稳定；肿瘤内可检出ADC蓄积（抗MMAF IHC及Western blot）及CD98hc轻度下调，治疗组Cyclin B、pHH3升高，Cleaved Caspase-3/PARP增加——重现体外机制。原位OVCAR8-luc模型：仅抗CD98hc–MMAF组显著抑制腹腔生物发光信号（p<0.05 vs 对照组、游离MMAF、同型IgG–MMAF及裸抗体），尸检未见腹膜种植结节，其他组均有广泛种植灶；各组体重无差异——结论：人源化抗CD98hc–MMAF在两种小鼠模型中显著抑制卵巢癌皮下生长及腹膜转移，无明显全身毒性表现。

讨论与结论（翻译浓缩）：

卵巢癌患者肿瘤组织及腹水中CD98hc表达显著高于正常卵巢组织且定位于细胞膜，抗CD98hc抗体可有效结合并内化至溶酶体。携带MMAF载荷的抗CD98hc ADC在体外（IC₅₀62–73 pM）、患者腹水原代细胞及体内异种移植模型中均展现强效抗肿瘤活性，机制为微管破坏致G2/M阻滞、纺锤体异常、有丝分裂灾难及凋亡。其人源化版本（基于IGN523，Ⅰ期AML试验中显示耐受良好）在小鼠中抑瘤且无显著毒性。尽管鼠CD98hc不被交叉结合故无法完全评估on-target off-tumor毒性，但既往临床数据与跨肿瘤CD98hc ADC临床前研究支持其治疗窗探索价值。抗CD98hc–MMAF对铂耐药细胞及FRα阴性/低表达细胞有效且体外活性优于Mirvetuximab Soravtansine，联合策略与疗效预测标志物值得进一步研究。综上，本研究验证CD98hc是卵巢癌ADC可行靶点，抗CD98hc–MMAF具强效体内外抗肿瘤作用，支持其向临床开发推进。