利用高级糖组学方法研究创伤性脑损伤中IgG糖链变化及免疫调节机制

《Analytica Chimica Acta》：Advanced Glycomics Approach for Characterization of IgG Glycan Alterations and Immune Modulation in Traumatic Brain Injury

　　谢里夫丁·奥尼格宾德|乔伊·所罗门|维沙尔·桑迪利亚|奥卢瓦托辛·达拉莫拉|莫吉博拉·福沃韦|莫因奥卢瓦·阿德尼伊|菲拉斯·H·科贝西|斯特法尼亚·蒙德洛|艾娃·M·普奇奥|耶希亚·梅赫雷夫
美国得克萨斯州卢博克市得克萨斯理工大学化学与生物化学系，邮编79409

**摘要**
**背景**
创伤性脑损伤会引发严重的健康问题，涉及复杂的免疫反应和神经炎症。在创伤性脑损伤中，免疫球蛋白G通过Fc糖基化依赖的机制在调节神经炎症反应中起着关键作用。然而，由于结构多样性、样本获取困难以及其他糖蛋白的干扰，要在复杂的生物基质中准确表征IgG Fc糖基化仍具挑战性。本研究提出了一种低输入量且具有选择性的LC-MS/MS基糖组学分析方法，利用GlycINATOR（EndoS2）可直接从未分离的血清样本中全面分析IgG Fc N-糖链。该酶能选择性切割Fc连接的N-糖链，从而无需对IgG进行纯化，且样本量仅需10微克总蛋白质（小于1微升血清）。该方法结合了固相过甲基化处理和高分辨率LC-MS技术。

**结果**
GlycINATOR（Endo S2）对IgG Fc糖基化具有高度特异性，对其他糖蛋白无显著活性，消化效率为92.2±2.5%。该方法的重现性良好，糖链峰面积的相对标准偏差低于8%，保留时间相对标准偏差在0.10%-0.30%之间（N=3）。与Endo F3相比，该方法在定量分析上表现优异，且Fc选择性更强。应用于创伤性脑损伤血清样本后，发现糖基化模式存在明显变化，表现为唾液酸化程度增加，而IgG中的双分支GlcNAc及无半乳糖化现象减少。此外，在经过GlycINATOR（Endo S2）处理后，剩余的非IgG糖蛋白中的糖链也发生了显著重构。这些糖基化变化与创伤性脑损伤中的复杂免疫相关改变一致。通过异构体分辨分析，进一步发现了特定的连接方式变化，尤其是α2,6-唾液酸化程度增加，而α-6连接半乳糖化程度降低，这可能对免疫相关过程有影响。

**意义与创新点**
该方法整合了糖组学技术，可直接从未分离的血清样本中以低输入量、高选择性分析IgG Fc特异性糖链。该方法减少了样本需求，无需预先纯化IgG，且可通过同一样本制备同时分析IgG特异性N-糖链以及非IgG糖蛋白中的N-糖链。

**引言**
创伤性脑损伤是一种严重的公共卫生问题，尤其影响年轻人，全球每年约有6400万至7400例此类病例[1][2]。当外部机械力量如突然的撞击或冲击作用于头部时，会导致正常脑功能紊乱，进而引发神经功能障碍[3][4][5][6]。创伤性脑损伤的严重程度从轻微的脑震荡到可能导致长期残疾甚至危及生命的中度及重度损伤不等[5][7]。它还与阿尔茨海默病、帕金森病以及慢性创伤性脑病等持续性神经系统疾病密切相关[8][9][10]。创伤性脑损伤的发病机制十分复杂，包括神经元损伤、炎症反应、氧化应激以及血脑屏障功能受损等[11][12][13][14]。格拉斯哥昏迷量表是评估创伤性脑损伤严重程度的主要临床工具，得分14-15表示轻度损伤，9-13为中度损伤，3-8则为重度损伤[15]。胶质纤维酸性蛋白和泛素C端水解酶L1等生物标志物进一步提升了创伤性脑损伤的诊断和预后能力[16][17]。不过，格拉斯哥昏迷量表在监测治疗反应或检测细微的神经功能变化方面存在局限，而胶质纤维酸性蛋白和泛素C端水解酶L1主要反映急性损伤，难以用于长期评估。因此，亟需更多生物标志物来更好地监测病情、对患者进行分类，并了解创伤性脑损伤中的免疫反应及糖基化变化。

免疫系统活动是创伤性脑损伤病理生理过程中的重要因素[18][19][20]。在初始的机械性损伤之后，一系列炎症反应会被触发，涉及中枢神经系统和外周免疫系统[21][22][23]。作为对损伤的反应，小胶质细胞会被激活并分泌多种促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6[24][25]。此外，单核细胞和中性粒细胞等外周免疫细胞也会渗入大脑，进一步加剧炎症反应[26]。这种神经炎症反应既有益处也有害处，它既能促进组织修复，也可能导致继发性损伤和慢性神经退行性变[27][28]。了解免疫介质，尤其是免疫球蛋白在这一过程中的作用，对于发现潜在的生物标志物和治疗靶点至关重要。

免疫球蛋白G通过与Fcγ受体和补体蛋白相互作用来发挥多种免疫功能[29]。IgG的Fc区域会发生糖基化，而这些糖链对受体结合、补体活性以及后续的免疫和炎症反应起着关键调控作用[30][31][32][33][34]。具体而言，IgG糖基化的变化与多种疾病相关，包括自身免疫性疾病[31][35][36]、各类癌症[37][38][39]以及神经退行性疾病[40][41][42]。岩藻糖基化、半乳糖基化、双分支GlcNAc以及唾液酸基化等糖基化模式的差异，会显著影响IgG的功能，进而影响其与Fcγ受体及补体蛋白的相互作用，从而调控免疫反应[32][43][44][45]。鉴于其他神经炎症性疾病中的相关研究结果，创伤性脑损伤很可能也会引起IgG糖基化变化，进而影响免疫信号传导和恢复过程。糖基化模式的变化可能成为判断创伤性脑损伤进展程度的诊断生物标志物，反映免疫功能的紊乱程度。研究创伤性脑损伤患者的IgG糖基化情况，有望为了解免疫反应并提供新的治疗靶点。尽管已有大量关于创伤性脑损伤后炎症反应的研究，但关于IgG糖基化在创伤性脑损伤相关免疫调节中的作用，目前仍存在较多知识空白。造成这一现状的原因之一是用于充分分析的样本数量有限，可用于探索性研究的创伤性脑损伤样本集也较为匮乏。另一个挑战在于糖链的结构复杂性，以及现有分析方法的局限性，这些方法往往缺乏进行全面糖基化分析所需的灵敏度和特异性。因此，迫切需要先进的分析技术，能够实现对IgG糖链的高精度、可重复且具有异构体识别能力的分析。

为解决这些问题，我们结合了基于GlycINATOR（EndoS2）的Fc糖链释放技术、固相过甲基化处理、高分辨率LC-MS/MS分析以及基于MGC的异构体分离技术，从而可以直接从未分离的血清样本中分析IgG Fc糖基化情况。通过这些分析技术的组合，只需10微克总血清蛋白，即不到1微升的血清，且无需预先纯化IgG，即可选择性分析IgG Fc N-糖链。此外，这一集成方法还允许使用相同的样本制备技术，进一步分析剩余血清糖蛋白中的N-糖链。因此，本研究的主要贡献在于，将成熟的糖组学分析技术简化应用，实现了对创伤性脑损伤血清样本中低输入量、高选择性且具有异构体信息的糖链分析。通过应用这一方法，我们发现了与创伤后急性期和亚急性期相关的IgG Fc糖基化变化，为在更大规模的创伤性脑损伤患者群体中开展Fc糖基化研究提供了依据。除了创伤性脑损伤之外，该方法还可用于研究其他免疫相关疾病中的IgG糖基化情况。

**样本信息**
血清样本来自匹兹堡大学旗下的脑创伤研究中心数据库，该中心是一家一级创伤治疗机构（IRB编号19030228，负责人为普奇奥）。该数据库招募了16至80岁、患有严重创伤性脑损伤的个体，其诊断标准为格拉斯哥昏迷量表评分在4-10分之间，且通过CT检查确认存在颅内损伤。此外，根据标准治疗要求，这些患者还需安装外部脑室引流管，以便进行颅内监测和脑脊液引流。

**化学品与材料**
碳酸氢铵、硼氨、甲酸、二甲基亚砜、碘甲烷、氢氧化钠珠、胎球蛋白、核糖核酸酶B、单克隆抗体、α-1-酸性糖蛋白以及聚醚砜5KDa膜离心过滤器均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma Aldrich公司。磷酸盐缓冲液则来自美国纽约州One Riverfront Plaza的Corning?公司。PNGase F则由新英格兰生物实验室提供。

**从血清样本中制备IgG特异性N-糖链**
首先使用Micro BCA蛋白测定试剂盒（赛默飞世尔科技，伊利诺伊州罗克福德市）测定蛋白质浓度，然后小心地将相当于10微克人血清体积的样本滴加到5KDa膜过滤器上，再用1X磷酸盐缓冲液稀释至总体积为50微升。接着向样本中加入10单位的GlycINATOR（EndoS2），在37摄氏度下孵育1小时。之后将样本冷却至室温，再按照制造商的建议以14,000×g的转速离心10分钟，收集滤液。

**GlycINATOR（Endo S2）处理后从非IgG富集糖蛋白中制备N-糖链**
在5KDa膜过滤器上的剩余蛋白质中加入40微升50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲液，以便高效地用PNGase F进行消化。加入1微升（1000单位）的PNGase F后，将反应混合物在37摄氏度下孵育18小时，使糖蛋白中的N-糖链释放出来。随后将样本冷却，并以14,000×g的转速离心10分钟，收集来自非IgG富集糖蛋白的N-糖链。这些样本需要经过两次冲洗，以确保完全回收N-糖链，然后将所有洗脱液混合在一起。

**N-糖蛋白组学样本制备**
将相当于10微克血清蛋白体积的样本进行EndoS2消化，以切断Fc N-糖链。将这些样本加载到5KDa膜过滤器上，用磷酸盐缓冲液稀释至50微升，然后在37摄氏度下与10单位的EndoS2共同孵育1小时。离心后，将滤液中的释放出的糖链单独收集起来，而保留下来的IgG蛋白部分则通过倒置过滤器并再次离心来获取。将得到的蛋白部分干燥后，重新溶解在50毫摩尔/升的铵溶液中。

**采用LC-MS/MS技术分析N-糖链**
我们采用了之前建立的方案，对19例创伤性脑损伤患者和19例健康对照组的血清样本中释放出的N-糖链进行LC-MS/MS分析[49]。将相当于1微克蛋白质所含量的过甲基化N-糖链溶液注入LC-MS/MS系统。糖链分析是在一台UltiMate 3000 nano UHPLC系统（赛默飞世尔科技，加利福尼亚州圣何塞市）上进行的，该系统与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪（赛默飞世尔科技，加利福尼亚州圣何塞市）相连，分析过程中采用了特定的运行参数。

**采用MGC LC-MS/MS技术进行N-糖链的异构体分析**
IgG衍生的N-糖链异构体是通过一种自主研发的10毫米介孔石墨碳填充柱进行分离的，该柱已被证明能够有效区分过甲基化糖链的异构体[53]。为了获得最佳分离效果，采用了90分钟的多级梯度洗脱程序。流动相A的组成为98%的水、2%的乙腈以及0.1%的二氟乙酸，而流动相B的组成则为50%的乙腈、50%的异丙醇以及0.1%的二氟乙酸。色谱分析在75摄氏度下进行，流速为0.3毫升/分钟。

**采用LC-MS/MS技术进行糖蛋白组学分析**
糖肽消化产物被重新溶解在含有0.1%甲酸的2%乙腈溶液中，浓度为1微克/微升，然后注入1微克的样本进行分析。首先将这些肽段捕获在C18捕集柱上（75微米×2厘米，2微米，100埃），然后在Acclaim PepMap C18分析柱上进行分析，分析柱的参数为75微米×15厘米，2微米，100埃，分析过程在UltiMate 3000 nanoUHPLC系统中进行，流速为0.35毫升/分钟，温度为29.5摄氏度。洗脱梯度为：前10分钟溶剂B的比例为3%（98%乙腈，0.1%甲酸），40分钟时比例上升至45%，46分钟时上升至80%，保持该比例4分钟，之后再次下降至3%，用于N-糖组学分析。

N-糖组学实验的原始数据是通过Xcalibur 4.4软件（赛默飞世尔科技）进行处理。糖链的理论质量离子值，包括多种电荷状态及其加成物，都是通过手动计算得出的，这些数值被用来识别N-糖链。对于GlycINATOR（EndoS2）处理后的样本，由于该酶的作用，其对应的糖链质量离子值会在计算时少一个HexNAc单元。为了手动识别所有的N-糖链，设置了5ppm的质量容忍度，这些候选糖链随后还会通过进一步的验证来确定。

**IgG Fc N-糖链以及非IgG富集糖蛋白中N-糖链的分析流程概述**
GlycINATOR（EndoS2）酶会切割Fc区域的N-糖链，留下核心的GlcNAc结构，该结构可能带有岩藻糖，也可能不带岩藻糖（见图1A）。如果两种N-糖链的核心结构仅存在一个岩藻糖的差异，那么经过GlycINATOR（EndoS2）处理后，它们的质量离子值将会相似。图S1展示了一个经PNGase F处理和一个经GlycINATOR（EndoS2）处理的单克隆抗体的分析结果。上方的曲线为PNGase F处理后的结果，显示出两个峰，它们仅在一个核心岩藻糖的数量上存在差异。下方的曲线为GlycINATOR（EndoS2）处理后的结果，此时仅出现一个峰。

**讨论**
本研究提出的集成分析方法为低输入量分析创伤性脑损伤患者和健康对照组血清样本中的IgG-Fc特异性N-糖链以及非IgG富集糖蛋白中的N-糖链提供了一种实用的方法。这些分析仅需10微克总血清蛋白，即不到1微升的未稀释血清，这在临床样本量有限的情况下尤为重要。

**传统基于PNGase F的IgG糖基化分析方法**
**本研究存在的局限性**
本研究也存在一些需要承认的局限性。该研究组的规模相对较小（n=13名TBI患者），这限制了分析的统计效力，也降低了研究结果在更广泛的TBI人群中的普适性。由于样本量小，无法对临床混杂因素进行调整，因此无法排除这些因素的影响。未来需要开展纳入更多、更多样化患者群体的研究，以验证并拓展这些发现。

结论：本研究提出了一种整合的工作流程，用于分析与TBI相关的IgG特异性N-糖链以及非IgG富集糖蛋白中的N-糖链。我们采用了结合GlycINATOR（EndoS2）酶解、固相过甲基化以及高分辨率LC-MS/MS的技术，对TBI患者及无TBI对照组的血清样本中的糖链结构差异进行了分析。研究结果显示，TBI与显著的糖基化改变相关，尤其是IgG糖链的结构变化更为明显。

CRediT作者贡献声明：
Joy Solomon：写作——审稿与编辑、验证、正式分析、数据整理。
Sherifdeen Onigbinde：写作——初稿撰写、验证、方法学、研究实施、正式分析、数据整理。
Yehia Mechref：写作——审稿与编辑、可视化、监督、资源协调、项目管理、资金获取、概念设计。
Ava M. Puccio：写作——审稿与编辑、监督。
Stefania Mondello：写作——审稿与编辑、监督。
Firas H. Kobeissy：写作——

利益冲突声明：作者声明没有已知的财务利益或可能影响本文研究结果的个人关系。

数据可用性：原始数据存储在GlycoPost上，访问编号为GPST000631。审稿人可访问的链接为：https://glycopost.glycosmos.org/preview/103114503669caa92d3db32；密码为1569。

利益冲突声明：? 作者声明没有已知的财务利益或可能影响本文研究结果的个人关系。

致谢：本项工作得到了美国国立卫生研究院（1R01GM130091-06，1R01GM112490-10）、Robert A. Welch基金会（编号D-0005）以及CH基金会的资助。