紫外光解技术揭示金属离子调控的KRAS构象动态变化

《Analytica Chimica Acta》：Metal Ion-modulated KRAS Conformational Dynamics Unraveled by Ultraviolet Photodissociation

　　

金志雄|杨世瑞|刘哲毅|吴浩哲|赵恒|陈东|赵珊|罗成|王芳军|潘远江

中国浙江大学化学系，杭州310027

摘要

金属离子是调控蛋白质构象与生物功能不可或缺的辅助因子。然而，由于金属离子调控作用具有高度动态性和复杂性，利用传统结构生物学方法难以捕捉金属离子引发的构象变化并解析这些结构细节。在此，我们采用原生质谱技术（nMS）和193纳米紫外光解技术（UVPD）来研究Kirsten大鼠肉瘤蛋白（KRAS）中金属离子依赖的构象变化。通过实现高序列覆盖率，我们为天然Mg²⁺辅助因子建立了生物物理基准，揭示了其结构变化如何调控功能开关环，从而使KRAS处于紧凑且无活性的状态。此外，我们发现Zn²⁺可竞争性取代Mg²⁺，虽保持整体紧凑结构，但会改变局部稳定性，提升活性位点及开关区域的灵活性。我们的研究阐明了金属离子如何调控KRAS的构象动态，为探索更广泛的金属蛋白的变构调控提供了基于质谱的灵敏分析策略。

引言

大约三分之一的人类蛋白质组依赖金属离子作为重要辅助因子，这些离子在调控蛋白质结构及变构调控过程中起着关键作用。[1], [2], [3], [4], [5] 金属蛋白为了满足金属离子结合的精确几何与化学要求，演化出了复杂的配位网络。[6], [7], [8] 因此，若用其他离子竞争性取代天然金属辅助因子，可能会破坏这一精密调控网络，进而改变蛋白质的构象与内在活性。RAS家族蛋白中存在的金属离子依赖性差异就体现了这种功能差异。[9], [10], [11], [12] 所以，精准描述金属离子引发的构象变化对于理解蛋白质调控机制至关重要。

传统上，金属蛋白复合物的结构研究主要依靠X射线晶体学和核磁共振技术。尽管这些方法能提供高分辨率的静态结构图像，但在捕捉高度动态的多种构象及短暂的变构反应方面存在局限。[13], [14], [15], [16], [17] 为弥补这一缺陷，原生质谱技术结合193纳米紫外光解技术便成为一种有效的分析工具。该技术可通过高效的主链断裂，实现对构象变化的定量分析，超越传统静态结构模型的限制。[18], [19], [20], [21], [22], [23]

Kirsten大鼠肉瘤蛋白（KRAS）是调控正常细胞生长和致癌转化的重要信号通路中的关键分子开关，由于其难以被药物修饰，因此成为研究金属离子依赖性功能动态的理想模型。[24], [25] KRAS依赖内源性的Mg²⁺来维持其与核苷酸结合的稳定构象。[26], [27], [28] 不过，由于Zn²⁺的离子半径与Mg²⁺相近，二者可能存在竞争性相互作用。虽然已有同源蛋白Rac1与Zn²⁺相互作用的静态结构研究，但Zn²⁺对KRAS构象的影响尚未明确。[10] 本研究利用原生质谱技术和193纳米紫外光解技术分析KRAS-Mg²⁺/Zn²⁺复合物，揭示不同金属辅助因子对KRAS构象动态的影响，阐明其竞争性配位的结构原理。

内容节选

蛋白质表达与纯化

KRAS^WT基因被克隆到含有N端6×His标签和TEV蛋白酶切割位点的pET-28a载体中。该蛋白在E. coli BL21 (DE3)细胞中表达，这些细胞先在含50 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基中培养过夜，随后在37°C下用0.4 mM异丙基β-D-硫半乳糖苷诱导表达5小时。之后收集细胞，置于Ni-A缓冲液（20 mM HEPES pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM MgCl₂、10 mM咪唑以及0.7‰ β-巯基乙醇）中通过超声处理进行裂解。上清液随后被用于后续分析

结果与讨论

在原生质谱谱图中，KRAS复合物主要以单体形式出现，其电荷状态分布范围为7+至9+，其中8+电荷状态的物种最为丰富（见图2A和S3）。相对较低且狭窄的电荷状态分布表明，KRAS的天然紧凑结构在质谱分析中得以保留。[33], [34], [35] 此外，所有KRAS分子都处于与GDP结合的状态，未检测到无核苷酸形式的物种。[KRAS-GDP]⁸⁺在没有辅助离子存在时，其结构中心位于

结论

综上，我们通过结合原生质谱技术与193纳米紫外光解技术，研究了金属离子引发的KRAS细微构象动态。首先，我们为Mg²⁺辅助因子建立了生物物理基准，该辅助因子能够使功能开关环处于无活性状态。当Zn²⁺取代Mg²⁺后，KRAS-GDP复合物虽然保持整体封闭的紧凑结构，但其局部稳定性发生改变，使得关键的开关环具有更高的灵活性。这些观察结果表明

CRediT作者贡献说明

金志雄：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、软件应用、方法设计、实验实施、正式分析、概念构思。杨世瑞：软件应用、方法设计、实验实施、正式分析。刘哲毅：写作——审阅与编辑、研究指导、软件应用、方法设计、资金获取、正式分析。罗成：研究指导、资源提供。王芳军：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、研究指导、项目管理、资金获取

未引用参考文献

[45]。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2025YFA1309300、2022YFC3400502）、中国国家自然科学基金（项目编号22525406、22574159和22288201）以及中国科学院战略性先导科技专项（项目编号XDB0970102）的支持。同时，我们感谢大连相干光源中心生物质谱系统团队（https://cstr.cn/31127.02.DCLS.ESBMS）在技术支持方面的帮助