《Biosensors and Bioelectronics》：An Amplification-Free Dual-Readout Biosensor Integrating Colorimetry and Single-Particle Counting for Ultrasensitive miRNA Detection in Esophageal Cancer
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张文静|王安宇|何哲言|陈佳丽|周雨航|李新英|辛伟妮|郑晓辉|李晨忠|蒋成中国香港中文大学医学院，深圳518172摘要食管癌具有极高的致死性，部分原因在于许多患者在疾病晚期才被诊断出来，而目前的诊断方法仍依赖于有创内镜检查及集中的分子检测。循环微小RNA是一种颇具前景的微创生物
张文静|王安宇|何哲言|陈佳丽|周雨航|李新英|辛伟妮|郑晓辉|李晨忠|蒋成
中国香港中文大学医学院，深圳518172
摘要
食管癌具有极高的致死性，部分原因在于许多患者在疾病晚期才被诊断出来，而目前的诊断方法仍依赖于有创内镜检查及集中的分子检测。循环微小RNA是一种颇具前景的微创生物标志物，但基于扩增的检测方法往往流程复杂，且可能存在与实验方案相关的偏差。在此，我们报道了一种无需扩增的双读数金纳米粒子生物传感器，可用于分析血浆RNA提取物中的hsa-miR-320b。目标miR-320b可将链霉亲和素磁珠上的生物素化捕获探针与40纳米金纳米粒子上的硫醇化检测探针连接起来，形成三明治复合物。通过统一的磁分离流程，可实现两种连续的检测方式：一种是基于上清液中金纳米粒子减少情况的比色验证（检测限为0.085皮摩尔），另一种是数字释放计数模式，即RNase H选择性切割DNA/RNA杂双链中的RNA链，从而释放出金纳米粒子-DNA标记物，以便在暗场显微镜下进行单颗粒计数（检测限为5.3飞摩尔），整个过程无需核酸扩增。该检测方法能够区分单碱基差异，具有短期储存稳定性，在血浆RNA提取物中的加标回收率在89.8%至92.9%之间。在60份临床血浆样本（20份食管癌样本、20份良性病变样本、20份健康对照样本）中，数字释放计数模式显示，与良性病变和健康对照组相比，食管癌患者的血浆miR-320b水平升高，这一趋势与对相同样本进行的逆转录定量PCR检测结果一致。这项工作为无需扩增即可实现数字化miRNA定量分析提供了实用方法，而且还可轻松应用于其他循环靶标。
引言
食管癌具有极高的致死性，因为许多患者在疾病晚期才被诊断出来（Teng等人，2024年），而目前的诊断方法仍依赖有创内镜检查及集中的分子检测（Evans等人，2013年）。这就使得临床上亟需一些微创检测方法，以便在无法进行内镜检查或集中分子检测时，能够用于早期筛查、风险分层以及长期监测。
液体活检生物标志物颇具潜力，但血液中具有临床意义的核酸靶标往往含量极低，还容易受到基质背景、非特异性吸附以及序列交叉反应的影响（Song等人，2025年；Xu等人，2025年）。循环微小RNA就面临着这样的挑战：尽管它们在生物流体中较为稳定，也被广泛认为是与疾病相关的标志物（de Scordilli等人，2025年；Han等人，2025年；Lv等人，2025年），但在血浆中的内源性浓度通常仅在低飞摩尔到亚皮摩尔范围内（Mitchell等人，2008年），这使得在食管癌等癌症研究中，难以同时实现操作简便性和临床所需的灵敏度（Chen等人，2024年；Wu等人，2025年）。
目前用于检测微小RNA的参考方法，包括逆转录定量PCR、液滴数字PCR以及测序技术，虽然具备出色的分析灵敏度和动态范围（Chen等人，2005年；Chen等人，2022年；Hou等人，2023年；Morin等人，2008年），但通常需要多步骤的操作流程、专业的技术人员以及先进的仪器设备（Yan等人，2025年）。此外，基于扩增的检测方法可能会由于逆转录效率和扩增动力学的原因而产生与序列和实验方案相关的偏差，而且往往需要严格的质控措施才能保证不同实验批次和实验室之间的检测结果具有可比性（Liu等人，2025年）。这些限制促使人们寻求能够减轻操作负担，同时还能在复杂的生物流体中保持稳定检测性能的生物传感策略。纳米材料驱动的生物传感器已被广泛研究，旨在通过将识别功能与信号转导功能整合到更为简化的检测架构中，从而弥补现有方法的不足（Zhang等人，2023年）。在各类光学传感器中，金纳米粒子因其局域表面等离子体共振效应而备受关注，该效应既能带来悬浮液整体的比色变化，也能在暗场显微镜下产生等离子体光散射现象（Bordbar等人，2022年；Han等人，2020年；Li等人，2024年）。在基于散射的等离子体生物传感领域，现有的研究方法大致可分为两类：一类是基于强度或耦合效应的散射检测方法（Kim等人，2018年；Qi等人，2018年），另一类则是将目标识别转化为可计数光学对象的数字单颗粒计数方法，这种技术在目标物质含量较低的情况下具有明显优势（Xiong等人，2021年；Li等人，2024年）。然而，目前仍缺乏一种无需扩增的检测策略，能够在保持基于杂交反应的特异性的同时，提升在复杂生物流体中的检测灵敏度，而且理想的检测体系还应能在不重新设计核心化学反应机制的情况下，快速实现整体检测结果判定，以便用于常规检测验证（Hang等人，2024年；Izumi等人，2025年）。
在此，我们介绍了一种无需扩增的双读数生物传感器，它将磁分离技术、比色验证模式以及基于酶促释放计数的数字读取功能相结合，用于检测循环微小RNA。在目标微小RNA存在的情况下，携带生物素化捕获探针的链霉亲和素磁珠与经过修饰、带有检测探针的40纳米金纳米粒子会形成磁珠-微小RNA-金纳米粒子的三明治复合物。磁分离功能不仅能够实现样品的自动净化，还能确保两种检测方式所使用的样品处理标准一致。在比色模式下，目标微小RNA会促使金纳米粒子结合在磁珠上，从而使上清液中的游离金纳米粒子数量减少，进而减弱特有的红色色调，便于快速筛查和流程验证。在数字读取模式下，相同的三明治结构会被用于酶促释放计数：RNase H会选择性切割DNA/RNA杂双链中的RNA链，释放出金纳米粒子-DNA标记物，进而可在暗场显微镜下进行单颗粒计数。这种“识别-释放-计数”的转换机制将RNase H的酶学特异性融入到统一的磁珠-金纳米粒子三明治检测流程中，而且由于在酶促释放和数字计数之前会进行严格的磁分离清洗，因此有助于避免因非特异性吸附而产生的假阳性结果。
为了利用一个具有临床意义的靶标来展示我们该平台的分析性能，我们选择了hsa-miR-320b作为循环微小RNA的示例。先前的研究已经表明，miR-320b与食管癌相关，相关研究包括基于TCGA数据库的预后微小RNA分析、整合网络分析以及细胞系验证研究（Zhao等人，2015年；Li等人，2021年）。此外，一项基于血清的临床研究也发现，循环中的miR-320b与食管鳞状细胞癌的临床病理特征有关，比如淋巴结转移情况（Liu等人，2021年）。虽然在其他一些研究中，有更多微小RNA被提及与食管癌诊断相关，但我们的无需扩增的数字读取检测流程并不局限于某一特定靶标，可以轻松适配其他微小RNA靶标或多种靶标联合检测方案。因此，我们在与生物流体特性相匹配的条件下优化了这种统一的捕获和酶促释放计数检测流程，然后使用来自食管癌患者、良性食管病变患者以及健康对照者的临床血浆RNA提取物进行了测试。在这项概念验证研究中，使用血浆RNA提取物有助于统一不同存档样本的检测条件，同时也便于与对相同样本进行的逆转录定量PCR检测结果进行直接比较。未来，或许还可以对该检测流程进行改进，实现无需提取样本即可直接对血浆进行检测（Wang等人，2024年）。值得注意的是，该数字读取检测方法具备5.3飞摩尔的检测限，在60份样本的概念验证研究中，就能够检测出食管癌患者血浆中升高的miR-320b水平。作为对比，我们对相同样本进行了逆转录定量PCR检测。总体而言，这项工作构建了一种统一的磁珠-金纳米粒子三明治检测架构，该架构既支持整体比色检测，也支持数字光学检测，且两种检测都在统一的磁分离流程中进行；同时还提供了一种无需扩增、利用RNase H实现释放计数的检测机制，提升了检测的灵敏度；此外，还建立了基于临床证据的评估体系，可用于分析食管癌患者血浆中的微小RNA。
章节节选
用DNA探针对金纳米粒子进行功能化处理
我们采用盐老化法，对40纳米的金纳米粒子进行硫醇化检测DNA的功能化处理。所有玻璃器皿在使用前都先用NaOH清洁过，然后再用超纯水彻底冲洗。具体操作为：将100微升的金纳米粒子与15微升的0.1毫摩尔的检测DNA混合，先将检测DNA用1微升浓度为500毫摩尔的醋酸钠缓冲液（pH值为5.2）和0.5微升浓度为10毫摩尔的TCEP处理1小时，使其活化。之后将混合液在室温下、在黑暗环境中、轻轻摇晃的状态下培养16小时。随后逐步加入NaCl
双读数检测方法的工作原理：从快速流程验证到超高灵敏度的单颗粒计数
我们所设计的生物传感平台采用了磁珠辅助的三明治杂交检测方案，该方案具有两种互补的检测功能：一种是为流程验证而设计的快速比色检测模式，另一种则是基于暗场显微镜下单颗粒计数的超高灵敏度数字检测模式（见图1）。涂有链霉亲和素的外层磁珠上连接有生物素化捕获探针，而40纳米的金纳米粒子则被修饰上了硫醇化检测探针；目标微小RNA则充当连接两种探针的桥梁，从而形成磁珠-微小RNA-金纳米粒子的三明治复合物，
结论
总结来说，我们通过将磁珠-金纳米粒子三明治检测架构与基于RNase H的释放计数数字检测功能相结合，开发出一种无需扩增、可用于检测循环微小RNA 320b的金纳米粒子生物传感器。统一的磁分离流程既可实现快速的比色验证功能，检测限为0.085皮摩尔；同时，利用相同的捕获结构，还能通过暗场显微镜下单颗粒计数技术实现对低飞摩尔浓度范围内的微小RNA进行定量分析，其经验证的检测范围为10飞摩尔到100皮摩尔，检测限为5.3飞摩尔
CRediT作者贡献说明
郑晓辉：论文撰写——审阅与编辑，资源准备。辛伟妮：资源准备。蒋成：论文撰写——审阅与编辑，研究指导。李晨忠：论文撰写——审阅与编辑，研究指导。陈佳丽：数据整理。何哲言：方法设计，数据整理。李新英：数据整理。周雨航：数据整理。王安宇：论文撰写——初稿撰写，方法设计。张文静：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，方法设计，正式数据分析，数据整理
利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何可能影响本研究结果的利益冲突。
伦理声明
该研究中所使用的血浆样本已获得广东省癌症研究临床伦理委员会的伦理批准，批准编号为G2022-042-01。
利益冲突声明
? 所有作者声明，他们不存在任何已知的、可能影响本文研究结果的财务利益关系或个人关系。
致谢
本项研究得到了以下机构的支持：国家自然科学基金委员会的普通项目（编号：82471500）、深圳孔雀团队计划（编号：KQTD20240729102029016）、广东省基础与应用基础研究基金的普通项目（编号：2024A515012060、2022A1515110206）、深圳科学技术计划项目（编号：2023SC0005、KJZD20230923115228056）、鹏城孔雀研究基金（编号：2024TC0150、KQ002573）、大学发展基金（编号：UDF01002573）、龙岗区重点实验室项目（编号：2025BD0001）以及广东省基础研究项目等
