综述：多重生物发光成像工具与技术的研究进展

《Current Opinion in Chemical Biology》：Advances in tools and technologies for multiplexed bioluminescence imaging

　　

生物发光是利用荧光素酶（luciferase）和荧光素（luciferin）进行非侵入式细胞及其他特征成像的常用方法。然而，由于工具集和适用检测方法的限制，多种探针的同时可视化历来具有挑战性。本综述聚焦于可降低多重成像技术门槛的生物发光技术最新进展。研究人员首先讨论了能够分辨多重靶点的新型荧光素和荧光素酶；随后展示了荧光素酶-荧光探针工程领域的最新发展，以实现多色读数；最后描述了检测硬件方面的创新，使生物发光发射体的捕获和分辨更加便捷。这些进展共同推动了活体系统中可观测前沿的拓展。

生物发光技术利用荧光素酶和荧光素小分子进行活体生物过程成像已有悠久历史。荧光素酶和荧光素通过化学反应产生光，无需外部照明。这一特性在厚组织及其他异质环境中进行成像时通常具有优势，因为在这些环境中使用激发光往往不切实际。生物发光探针开发的持续进步也使得观察生物学的新层面成为可能。更亮、更红移的工具为脑功能、转移性疾病等复杂活体动物过程提供了新见解。新型荧光素酶和检测平台还进一步实现了亚细胞水平的实时成像。

尽管生物发光能够追踪微观和宏观尺度的过程，但历史上同时可视化多个特征一直具有挑战性。生物发光探针相较于其他光学报告分子相当暗淡，且许多常用荧光素酶-荧光素对的发射 spectra 存在重叠。多重发射体在组织中尤其难以解卷积，因为光的吸收和散射会扭曲感知颜色。区分低水平光源通常需要昂贵的相机和复杂的图像分析工作流。即用型多重成像工具和技术的匮乏阻碍了许多生物发光应用。

近年来，得益于多重组分检测新探针和新方法的发展，这一局面已发生改变。许多进展的驱动力源于对整体更亮、组织穿透性更强的发射的需求。由此产生的平台现在基础研究提供了更全面的成像研究基础。本综述具体强调了三个重点领域：荧光素酶与荧光素的协同进化，其中合成化学和蛋白质工程提供了多种定制生物发光探针；扩展色板的荧光素酶-荧光受体融合蛋白；以及生物发光硬件创新，使多重光谱鉴定的仪器和方法更加普及。这些进展共同重新定义了活体系统中多重成像的极限。

在高质量成像工程化荧光素与荧光素酶方面，荧光素小分子始终是生物发光探针开发的核心。该骨架是最终的光发射体，核心结构的扰动会同时影响产生光的强度和颜色。自然界中存在化学上不同的荧光素，其中两种（D-荧光素和腔肠荧光素）长期以来被用于单个样品中分析物的串联检测。这些底物由独特的荧光素酶类别（分别为昆虫源和海洋源）加工，并表现出不同的发射峰值。然而，相对亮度的差异和重叠光谱使得仅通过颜色分离探针具有挑战性。因此，与许多生物发光工具类似，这些荧光素酶通常通过正交反应性荧光素的顺序添加逐一成像。

超越双靶点成像的需求推动了近年来的大量创新。自然界中很少有支架得到充分表征和/或具备生物相容性以用于活体系统的常规应用。因此，许多工作集中于生成具有理想性质的非天然类似物。这些包括已工程化以发射更多红光（从而最大化组织穿透性）的D-荧光素变体。一个突出的例子是AkaLumine，这是一种D-荧光素的π-延展衍生物，能够实现近红外发射（650–677 nm）。研究人员通过进化获得了修饰荧光素酶Akaluc（含28个突变），以高效加工该类似物。Akaluc/AkaLumine已被用于啮齿类动物肺组织和非人灵长类动物大脑中细胞的灵敏检测。其他红光发射类似物也有报道，包括infraluciferins、萘基类似物、环稠合NIRLucs、LH²支架、AkaSuke以及香豆素衍生物（CouLucs）。大多数这些类似物与AkaLumine一样，需要工程化荧光素酶以实现稳健的光产生。探针组也产生不同的发射谱型，尽管光谱仍然高度重叠。基于类似物的独特（正交）化学结构，多重成像应用仍然是可行的。事实上，通过顺序添加底物，利用红光发射生物发光探针的组合已实现了四组分成像。

平行的工程化努力也扩展了海洋源生物发光探针的数量。该类别中最广为人知的荧光素酶使用腔肠荧光素（CTZ）作为底物。这些酶的周转速率也快于昆虫源荧光素酶，产生足够的光以进行微观尺度成像。虽然明亮，海洋生物发光工具传统上因CTZ稳定性有限而遭受背景氧化的困扰。一个重大突破来自更稳健的酶-底物对的开发：NanoLuc/furimazine（Fz）。NanoLuc是OLuc的工程化变体，是迄今报道的最小荧光素酶之一。Furimazine比CTZ具有更少的自氧化和更好的细胞通透性。重要的是，NanoLuc-Fz比天然Fluc/D-荧光素和Rluc/CTZ亮150倍，并已在许多与成像、生物传感和光遗传学相关的应用中加以利用。

NanoLuc-Fz平台进一步激发了多种新型荧光素酶和荧光素的开发。Fz类似物（如CFz和FFz）已被生成，具有更好的生物利用度。通过Fz核心的π-延展和N-烷基取代也 pursued 了多色变体。这些类似物与NanoLuc一起提供了一系列颜色，但加工效率不如Fz，导致信号较暗。在某些情况下，额外的荧光素酶工程化已被用于恢复光子输出。一个值得注意的例子是diphenylterazine（DTZ）。该荧光素被teLuc高效氧化，teLuc与NanoLuc仅相差三个突变。teLuc-DTZ比NanoLuc-Fz更亮且更红移。与DTZ类似物-荧光素酶对的额外红移也是可能的，包括8pyDTZ-LumiLuc（532 nm）和QTZ-Qluc（585 nm），尽管这些探针稍暗。大多数Fz类似物-荧光素酶对之间也互不排斥，但可与AkaLumine/Akaluc及其他结构差异更大的工具串联使用。

额外的荧光素酶工程化努力扩展了多重成像的生物发光工具箱。一个例子包括紧凑且稳定的ALuc的开发，这些酶是从桡足类荧光素酶序列组合工程化而来。该类别中最小的picALuc（13 kDa）使用CTZ作为底物，尽管比NanoLuc-Fz暗30倍，但亮度与NanoLuc-CTZ相当。另一个近期例子是传感器支架荧光素酶（SSLuc）。SSLuc是通过多轮定向进化获得的OLuc变体。该荧光素酶与Fz一起提供比NanoLuc更高的光子输出。SSLuc被进一步工程化为提供生物发光钙指示剂（CaBLAM）。CaBLAM能够对小鼠单细胞神经活动进行动态读数，媲美最先进的光学探针。

探针设计也已超越天然存在的荧光素酶序列。研究人员最近利用AI引导的从头设计工程化了LuxSit-i（13.7 kDa），这是一种比NanoLuc更小更紧凑的骨架。该酶基于核转运因子2（NTF2）样蛋白家族，该家族与荧光素类似物DTZ具有形状互补性。计算幻觉和深度学习被用于鉴定候选酶，最有前景的设计经过实验测试并进一步优化。LuxSit-i及其第二代变体（neoLux）催化DTZ发光的能力可与一些天然生物发光系统媲美。从头设计的酶-底物对不如NanoLuc/Fz明亮，但预期会有额外改进。LuxSit和neoLux也与其他利用CTZ的荧光素酶正交，这一特性已被利用于多组分成像。

在通过共振能量转移实现颜色偏移变体方面，除调节荧光素发色团和周围微环境外，还通过F?rster共振能量转移（F?rster Resonant Energy Transfer, FRET）实现了改变的颜色。这一非辐射过程涉及生物发光供体（激发态荧光素）和附近的荧光受体。荧光素添加后观察到受体的发射，无需外部照明。最广为人知的受体包括荧光蛋白，尽管也可使用其他支架。

迄今为止，多种工程化的生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET）融合蛋白已被开发，现在覆盖整个可见光谱。早期例子以Fluc或Rluc作为生物发光供体。这些报告分子因融合蛋白相对较大而未获得广泛应用。也很少有色谱匹配Fluc的良好荧光蛋白。更流行的BRET报告分子以NanoLuc作为供体，充分利用了该荧光素酶的小尺寸和稳健性。NanoLuc已与多种不同荧光蛋白融合，以提供一系列独特的融合蛋白。例子包括LumiFluors和增强型Nano-lanterns（eNLs）。这些工具的组合已被用于监测一系列生物过程，包括钙动力学和转移性疾病。三种BRET报告分子（GpNLuc/YeNL/OeNL）最近被用于追踪肿瘤异质性。Fz给药后，所有三种报告分子的光可通过光谱解混。（待续）

额外的组织穿透性发射增益来自包含CyOFP1（大斯托克斯位移荧光蛋白）的BRET受体。将CyOFP1与NanoLuc（或相关变体）融合提供了偶联物（Antares和Antares2），其最大发射>580 nm且具有高BRET效率。Antares与CFz或FFz组合在体内可媲美Akaluc/AkaLumine，无需对NanoLuc供体进行额外工程化。Antares/CFz对已被用于自由移动小鼠的脑功能成像。类似的红色偏移发射增益来自将LumiLuc-8PyDTZ与mScarlet-I（另一种理想的红光发射荧光蛋白）的融合。

BRET报告分子工程化的额外进展扩大了多重成像的工具箱。Yeh及其同事通过将从头设计的荧光素酶与一系列荧光蛋白融合，扩展了neoLux的色板。所得融合蛋白实现了超越先前报道对的BRET效率。Nagai及其同事最近开发了eNLEX（enhanced Nano-Lantern EXpansion）平台。与大多数上述探针不同，eNLEX具有两个不同的荧光受体，两侧为NanoLuc供体。通过改变受体和连接长度，获得了大量的BRET融合蛋白。使用标准RGB相机可同时成像20种颜色。同一团队还通过将荧光蛋白与细菌lux操纵子编码的发光蛋白（luxAB）融合，为自主生物发光成像奠定了基础。该操纵子不仅编码功能性荧光素酶，还编码用于生物合成荧光素本身的酶。因此，所得平台可在细胞中提供一系列颜色，无需外源荧光素添加。

多色BRET不限于荧光蛋白受体。最近几项进展利用了化学遗传标签。这些蛋白质螯合可接受荧光素酶供体能量的小分子荧光团。熟知的化学遗传标签（如SNAP-tag和HaloTag）已与NanoLuc配对，为生物成像和生物传感提供色调可调的平台。最近报道了一种相关的罗丹明结合基序（Rho-tag），也适用于荧光素酶融合。研究人员利用小型（14 kDa）氟原结合域（pFAST）创建了BREAKFAST（Bioluminescence Resonance Energy mAKe over with a Fluorescence-Activating absorption-Shifting Tag）平台。该平台具有非共价氟原结合能力，通过简单更换配体实现实时色调调节。Gautier实验室最近开发了优化的荧光素酶-pFAST变体（LumiFAST），其表现出改善的BRET效率。LumiFAST被用于生成蛋白酶传感器和检测蛋白质-蛋白质相互作用，更多应用可期。相关工作将NanoLuc与近红外荧光激活蛋白（NirFAP680）融合。NirFAP680明亮、稳定且具有大斯托克斯位移。生物发光融合蛋白（NirNL）在亮度方面优于Antares，是体内双色成像的有前景的报告分子。

在硬件设计进展方面，得益于检测方法的持续创新，多色生物发光成像的技术门槛也在被降低。生物发光历来依赖昂贵的电子倍增电荷耦合器件（Electron Multiplying Charge Coupled Device, EMCCD）相机来捕获超低光子输出。然而，已鉴定出可捕获生物发光光的替代相机。这些包括科学互补金属氧化物半导体（scientific Complementary Metal Oxide Semiconductor, sCMOS）器件，其具有足够低的背景噪声，可捕获某些（但不是最暗的）生物发光探针。量子图像传感器（Quantum Image Sensor, QIS）器件进一步取得了进展。商业QIS相机最近被用于显微生物发光成像。该方法降低了读出噪声，改善了低光成像的空间分辨率和视野。

传统意义上的多色成像——通过标准滤光片收集不同波长——对生物发光而言常常复杂。信号可能暗淡、随时间 fleeting，且存在重叠。BRET报告分子的效率也<100%，这意味着经常观察到来自荧光素酶供体的残余光。其中一些障碍已通过更明亮探针的开发得到解决。具有NanoLuc级亮度及其相关BRET融合的荧光素酶可使用广泛可用的RGB数码相机或便携式手机进行检测。事实上，已报道了从比色传感器检测到细胞和鼠模型中多组分成像（曝光时间为秒至分钟级）的应用。

光谱重叠的生物发光信号可进一步通过计算方法分辨。例如，光谱解混算法已被用于解卷积复杂的发射光谱。此类算法计算密集，且通常在低浓度下无效。研究人员开发了一种可与任何相机接口的多组分成像替代方法：生物发光相量分析（bioluminescent phasor）。该技术可为给定图像中的多种组分提供定量且即时的读数，即使对于低丰度发射体也是如此。生物发光相量还利用广泛可用的仪器。

尽管并非专门为多色成像设计，近年来在生物发光检测设备层面也见证了重大突破。例如，重量仅2.5 g的微型化生物发光显微镜（BLmini）实现了对脑活动的动态灵敏成像。低光显微镜也得益于深度学习算法。一个特别令人瞩目的例子是在自由移动秀丽隐杆线虫中进行的钙成像。获得了三维高分辨率图像。微型化低光探测器还与微流控技术整合，提供了通过生物发光全细胞生物传感器监测分析物的便携式设备。

总之，近年来生物发光工具和技术开发激增。许多新型荧光素与工程化荧光素酶一起被开发。这些探针现在覆盖整个可见光谱，实现了通用的成像应用。与此同时，低水平光检测的进步正在推动可观测前沿的拓展。仅在过去两年内，就报道了深层组织中包括大脑在内的多靶点成像的几个例子。未来工作将继续解决工具箱中的空白。研究人员预期开发更亮的、在组织穿透区域发光的荧光体。由于非辐射衰减途径增加，>700 nm处观察到量子产率的急剧下降。解决这一"亮度天花板"对于体内更灵敏的成像至关重要。生物发光工具构建也将受益于对光产生背后光物理和光化学途径更深入的理解。最亮的荧光素酶目前仅提供约1–10光子/秒，远少于用标准激光照亮的荧光蛋白或小分子染料。弥合这一差距需要具有改进量子产率和更快周转速率的探针。在细胞水平上，细胞器特异性动态的高质量成像仍然是一项艰巨挑战。监测信号通路、代谢和脑化学等复杂性需要可连续且同时监测的探针。这些挑战需要可靠的探针和长期可视化的仪器。虽然过去几年取得了许多进展，但技术向更广泛社区的转化缓慢。需要改进材料放大和分发的方法。用户友好型探针和检测平台的传播将加强可视化活体系统中更多动态过程的工作。

论文主体内容围绕多重生物发光成像的工具与技术进展展开，可分为四个核心部分。

**工程化荧光素与荧光素酶用于高质量成像**

该部分系统阐述了通过合成化学与蛋白质工程协同优化荧光素-荧光素酶对以实现多重成像的策略。D-荧光素与腔肠荧光素作为经典底物，虽可通过昆虫源与海洋源荧光素酶的正交反应实现串联检测，但其亮度差异和光谱重叠限制了真正的多色分辨。为此，研究人员开发了多种π-延展的D-荧光素类似物，如AkaLumine及其配套荧光素酶Akaluc，实现了650–677 nm的近红外发射，并成功应用于啮齿类肺组织及非人灵长类大脑成像。其他红光发射类似物包括infraluciferins、萘基类似物、环稠合NIRLucs、LH₂支架、AkaSuke及香豆素衍生物CouLucs等，其中部分已利用正交化学结构实现四组分顺序成像。在海洋源系统方面，NanoLuc/furimazine（Fz）的突破尤为关键，该对子较传统系统亮度提升150倍，并催生了CFz、FFz等生物利用度更优的类似物，以及diphenylterazine（DTZ）与teLuc等更亮更红移的变体。此外，AI引导的从头设计荧光素酶LuxSit-i和neoLux，基于NTF2样apture like蛋白家族，与DTZ配对且与其他CTZ利用型荧光素酶正交，为多组分成像提供了新工具。

**通过共振能量转移实现颜色偏移变体**

该部分重点讨论了生物发光共振能量转移（BRET）技术扩展发射色板的方法。BRET依赖于生物发光供体与荧光受体之间的非辐射能量传递，无需外部激发。早期Fluc/Rluc供体系统因融合蛋白过大而未获广泛应用，而NanoLuc因其小尺寸和高亮度成为更优供体选择。基于NanoLuc的BRET融合蛋白如LumiFluors和增强型Nano-lanterns（eNLs）已广泛用于钙动力学和转移性疾病等过程的监测。近期，GpNLuc/YeNL/OeNL三色组合通过光谱解混实现了肿瘤异质性追踪。为增强组织穿透性，CyOFP1作为BRET受体与NanoLuc融合形成Antares系列，最大发射>580 nm，其中Antares/CFz已在自由移动小鼠脑功能成像中媲美Akaluc/AkaLumine系统。Nagai团队开发的eNLEX平台采用双荧光受体夹心NanoLuc供体的创新架构，通过受体和连接子变化产生了20种可同时成像的颜色。此外，化学遗传标签如SNAP-tag、HaloTag与NanoLuc的整合实现了色调可调；BREAKFAST平台利用pFAST域的非共价氟原结合实现实时配体交换调色；LumiFAST和NirNL等优化变体则在BRET效率和近红外发射方面取得显著进展。

**硬件设计的进展**

该部分综述了降低多重生物发光成像门槛的检测技术创新。传统EMCCD相机虽灵敏但成本高昂，sCMOS和QIS等替代设备正逐步普及。特别是QIS相机通过降低读出噪声，显著改善了低光成像的空间分辨率和视野，已用于NanoLuc标记细胞外囊泡的显微成像。对于光谱重叠信号，除光谱解混算法外，研究人员开发的生物发光相量分析技术（bioluminescent phasor）可与任意相机接口，即时定量解析低丰度多组分信号。同时，2.5克重的微型化生物发光显微镜（BLmini）实现了脑活动动态成像，深度学习辅助算法则提升线虫钙成像的三维分辨率，微流控整合的便携式设备拓展了生物发光全细胞生物传感器的应用场景。

**结论与未来展望**

该部分指出当前生物发光技术已能覆盖全可见光谱并实现深层组织多靶点成像，但仍面临>700 nm处量子产率急剧下降的"亮度天花板"挑战。未来需发展更高量子产率和更快周转速率的探针以弥合与荧光技术的亮度差距，同时改进细胞器特异性动态探针和长期可视化仪器，促进技术向更广泛研究社区的转化与普及。