泰国传统健脑复方Phy-Blica-O对抗LPS诱导神经炎症的神经保护机制：通过抑制小胶质细胞和实验小鼠中NF-κB通路发挥作用

《PLOS One》：Neuroprotective mechanisms of Thai traditional brain tonic Phy-Blica-O against LPS-induced neuroinflammation: Inhibition of NF-κB in microglia and mice

　　

Phy-Blica-O（PBO）是一种传统的泰国多草药复方制剂，历史上被用作健脑滋补和记忆增强剂。尽管其具有悠久的民族医学使用历史，但其神经保护机制尚未经科学验证。本研究首次提供了实验证据，表明PBO通过核因子κB（NF-κB）信号通路减轻脂多糖（LPS）诱导的神经炎症（该过程与神经退行性疾病的发展密切相关）。本研究旨在探讨PBO在LPS诱导神经炎症中的神经保护作用，重点关注其在体内外调控NF-κB信号通路的能力。研究人员通过高效液相色谱法（HPLC）对PBO的关键成分进行了定量分析。抗氧化能力采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）法进行评估。PBO的抗神经炎症效应在BV-2小胶质细胞及LPS攻击的雄性C57BL/6J小鼠中进行了评估。炎症介质和细胞因子在mRNA和蛋白水平进行了定量分析。NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路活性被评估以阐明PBO的作用机制。PBO预处理显著降低了LPS诱导的一氧化氮（NO）过量产生（从15.69±1.63降至8.74±0.25 μM，250 μg/mL，p<0.001）、促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达分别降低25%、31%和19%，p<0.05）以及炎症介质（iNOS和COX-2蛋白表达分别降低41%和29%，p<0.05）。机制分析揭示，PBO主要通过抑制NF-κB信号通路发挥其保护作用，在250 μg/mL浓度下体外试验中p-IκBα水平降低23%（p=0.018），p-p65水平降低34%（p=0.039），而对MAPK信号通路无显著影响。这些体外发现得到了体内实验结果的验证，其中口服PBO（100 mg/kg，持续7天）显著降低了LPS攻击小鼠脑组织中iNOS和COX-2的mRNA表达（p=0.041和p=0.018）以及促炎细胞因子水平。综上所述，研究结果证实了PBO作为神经保护滋补品的传统用途，并突显其作为预防或管理与神经退行性变相关的神经炎症性疾病的经济有效治疗候选物的潜力。有待进一步研究评估其生物利用度、长期安全性和行为学疗效。

神经退行性疾病是全球范围内导致残疾和病残的主要原因，由于其对老龄化人群的深远影响，正日益成为备受关注的公共卫生问题。阿尔茨海默病（AD）是痴呆症中最常见的形式，约占所有病例的60%-80%。截至2022年，全球超过5000万人受到这种神经认知障碍的影响，其中近60%生活在低收入和中等收入国家。泰国作为中等收入国家，AD已成为痴呆症的主要病因，占诊断病例的50%-75%。尽管报告显示泰国人群中痴呆症的患病率约为2%-3%，但近期研究发现泰国老年人轻度认知障碍（MCI）的患病率显著更高，超过70%。当前药物治疗仅能提供症状缓解，对疾病进展影响有限，这一空白推动了包括植物基复方制剂在内的补充替代疗法的研究兴趣。

Phy-Blica-O（PBO），又称THP-R016，是一种传统泰国多草药复方制剂，数十年来被用作健脑滋补和记忆增强剂。该复方包含11种药用植物，其中诃子（Terminalia bellirica）、川西青果（Terminalia citrina）和余甘子（Phyllanthus emblica）等均具有抗氧化和抗炎特性。神经炎症是神经退行性疾病进展的关键驱动因素，主要由活化的小胶质细胞介导，释放IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子。LPS诱导的神经炎症广泛用于模拟这些病理过程，其通过激活小胶质细胞上的Toll样受体4（TLR4），刺激NF-κB和MAPK信号级联反应，进而放大神经炎症反应。在此背景下，研究人员开展了本项研究，旨在系统探索PBO的神经保护潜力，将传统知识与现代神经药理学相结合，为PBO作为神经退行性疾病的潜在神经保护制剂建立科学依据。

本研究采用的样本来源于BV-2小胶质细胞系及雄性C57BL/6J小鼠（8-9周龄，24-27 g）。关键技术方法包括：高效液相色谱法（HPLC）进行化学成分定性与定量分析；DPPH、ABTS、FRAP、超氧阴离子自由基清除和过氧自由基清除能力测定评估抗氧化活性；MTT法检测细胞活力；Griess试剂法测定NO产生量；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测基因表达水平；蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析蛋白表达；以及免疫荧光检测NF-κB（p65）核定位等。

化学成分鉴定结果显示，PBO的主要神经保护标志化合物为鞣花酸（29.734 mg/g）、芦丁（16.335 mg/g）、绿原酸、阿魏酸和咖啡酸。抗氧化试验表明，川西青果、诃子、榄仁和余甘子对PBO的整体抗氧化能力贡献显著，其IC₅₀值在DPPH、ABTS和氮蓝四唑（NBT）试验中表现更优。

"BV-2细胞活力与NO产生"：PBO预处理对LPS诱导的细胞毒性具有剂量依赖性保护作用，250 μg/mL时细胞活力达到95.85±1.19%（p<0.001）。NO产生量从15.69±1.63 μM降至8.74±0.25 μM（p<0.001），表明PBO对LPS诱导的NO产生具有显著抑制效应。

"PBO抑制LPS诱导的促炎介质和细胞因子"：PBO预处理对iNOS和COX-2的mRNA及蛋白表达具有剂量依赖性抑制作用。iNOS蛋白表达从4.173±0.399降至2.467±0.738（p=0.023），mRNA表达从1.814±0.181降至1.399±0.192（p=0.026）。COX-2蛋白表达从3.068±0.429降至2.167±0.417（p=0.050），mRNA表达从1.752±0.398降至1.208±0.073（p=0.040）。TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达也显著降低，250 μg/mL时TNF-α从1.613±0.025降至1.206±0.158（p=0.006），IL-1β从1.752±0.398降至1.208±0.073（p=0.040），IL-6从1.638±0.108降至1.330±0.065（p=0.007）。

"PBO调控NF-κB而非MAPK信号通路的激活"：机制分析揭示，PBO通过降低IκBα和p65的磷酸化水平抑制NF-κB激活。250 μg/mL时，p-IκBα水平降低23%（p=0.018），p-p65水平降低34%（p=0.039）。然而，PBO对MAPK蛋白（ERK、JNK和p38）的磷酸化影响甚微，表明其对NF-κB通路具有特异性靶向作用。

"PBO减轻体内LPS诱导的神经炎症"：连续7天灌胃PBO（100 mg/kg）显著预防LPS诱导的神经炎症。iNOS mRNA表达从2.218±0.685降至1.221±0.301（p=0.041），COX-2 mRNA表达从2.648±0.869降至1.083±0.139（p=0.018）。iNOS蛋白表达从1.258±0.145降至1.006±0.116（p=0.039），COX-2蛋白表达从2.346±0.515降至1.151±0.296（p=0.013）。TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA水平也显著降低。NF-κB通路抑制在体内得到验证：p-IκBα在50和100 mg/kg组分别降至1.198±0.125（p=0.004）和1.064±0.113（p=0.002），p-p65分别降至1.289±0.234（p=0.020）和1.003±0.159（p=0.002）。

讨论部分指出，本系列研究旨在为泰国民间治疗师使用的"Ya-Ayuwatthana"（ rejuvenating agents）多草药复方提供科学证据。PBO中余甘子、榄仁和诃子是抗氧化能力的主要贡献者，其抗氧化、抗神经炎症和神经保护作用在既往研究中已得到证实。除咖啡酸外，所有化学标志物的抗炎机制均被鉴定为NF-κB激活的抑制，与本研究结果一致。六种草药组分已被报道可减轻LPS诱导的NO和PGE₂产生。PBO中鞣花酸、芦丁、阿魏酸、绿原酸和咖啡酸等化合物可能通过协同作用增强神经保护效果。然而，遗传多样性在解释治疗反应变异中起重要作用，PBO尚未在动物模型中进行行为学测试，其成分的药代动力学和生物利用度、慢性神经炎症条件下的安全性以及临床疗效和耐受性均有待验证。

研究结论部分指出：本研究首次以实验验证了PBO的神经保护作用。PBO通过抑制NF-κB信号通路，在细胞和动物模型中显著抑制LPS诱导的神经炎症，降低iNOS、COX-2及促炎细胞因子的表达。这些结果证实了其民族医学声誉，并表明其作为预防神经退行性炎性疾病的经济有效多靶点治疗候选物的潜力。然而，本研究未评估行为学结果、药代动力学或长期安全性，生物利用度及多成分间相互作用尚不清楚。未来研究应聚焦于药代动力学和毒理学评估、认知和运动模型的行为学测试，以及慢性神经退行性变模型研究，以确立其疾病修饰潜力。生物活性成分标准化及设计良好的临床试验对于确认人体疗效、安全性和最佳剂量同样至关重要。