《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Blocking False Positives in LAMP: A Review of Mechanisms and Advanced Technologies
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Fan Zhang|Xin Wang|Yunyi Li|Qi Zhang|Yunbo Luo|Nan Cheng中国农业大学食品科学与营养工程学院食品安全实验室，北京100083，中国摘要环介导等温扩增技术作为核酸扩增领域的重要技术，以其快速、简单和高灵敏度的特点而备受关注。然而
Fan Zhang|Xin Wang|Yunyi Li|Qi Zhang|Yunbo Luo|Nan Cheng
中国农业大学食品科学与营养工程学院食品安全实验室，北京100083，中国
摘要
环介导等温扩增技术作为核酸扩增领域的重要技术，以其快速、简单和高灵敏度的特点而备受关注。然而，在基于LAMP的核酸检测中，假阳性问题依然普遍存在，其主要原因是非特异性扩增和气溶胶污染。本文系统总结了目前用于防止LAMP出现假阳性的最新研究进展，从抑制非特异性扩增、避免气溶胶污染以及纠正错误信号三个方面进行探讨。首先，本文详细阐述了各种抑制非特异性扩增的技术，分析了这些技术的原理及其在抑制引物二聚体形成和调节Bst DNA聚合酶活性方面的作用。其次，介绍了防止气溶胶污染的相关技术，如去除污染的扩增产物以及开发封闭式扩增装置。随后，本文讨论了实现特定信号输出的方法，包括使用特异性信号探针以及扩增产物分析技术。最后，本文展望了基于LAMP的核酸检测的发展前景，为开发高可靠性的即时检测用LAMP生物传感器奠定了基础。
引言
核酸是重要的生物标志物，为食品安全检测领域的进步提供了重要支持。尽管聚合酶链反应因其高灵敏度和高特异性而被广泛用作低拷贝数核酸扩增的核心方法[1]，但它依赖于热循环仪，且处理时间较长、操作流程复杂，还需要熟练的操作人员[2]。这些限制使得PCR在即时检测中的应用受到很大制约[3][4]。为了解决对热循环仪的依赖问题，人们提出了多种等温扩增技术作为替代方案[5][6]。2000年，Notomi等人[6]发明了一种名为环介导等温扩增的技术。该技术在等温条件（通常为60–65?C）下，能够在不到一小时内将少量DNA扩增到109拷贝。由于LAMP具有很强的抑制剂耐受性[7]、高灵敏度[8]、无需热循环仪，且易于与微流控芯片结合使用[9]，因此被广泛应用于食品安全检测和即时检测等领域[10]。
目前，基于LAMP的核酸检测中假阳性现象较为普遍[11]。非特异性扩增[12]和气溶胶污染[13]是导致LAMP核酸扩增出现假阳性的主要原因。由于LAMP在等温条件下运行且没有退火步骤，体系中的单链DNA和双链DNA始终处于动态平衡状态，这有利于引物二聚体的形成，或者引物与模板之间出现错配[9]。LAMP体系中较高的引物浓度会增加引物二聚体形成的概率，从而产生非特异性扩增信号。Rolando, J. C.等人[14]利用下一代测序技术分析了非特异性扩增产物，发现它们是由全长FIP、BIP、它们的互补序列以及BIP片段混合而成的。Bst DNA聚合酶虽然具有极高的dNTP结合效率，但由于它具有从头合成DNA的能力[15][16]，缺乏校对功能，且在低温下活性较低[9]，因此在实验样品准备过程中很容易形成引物二聚体，进而引发非特异性扩增。此外，由于LAMP的扩增效率极高，先前LAMP反应产生的微量扩增产物可能成为后续扩增反应的模板，从而导致假阳性结果的产生[17]。
在本综述中，我们首先介绍了从源头抑制非特异性扩增的技术，重点探讨了抑制引物二聚体形成的方法，包括优化引物设计、使用添加剂降低引物同源性以及防止稳定二级结构的形成等。同时，我们还详细分析了纳米材料的作用，这类材料可以通过吸附引物来减少分子间相互作用，同时抑制低温下的Bst DNA聚合酶活性。接着，我们研究了防止气溶胶污染的策略，包括去除受污染的扩增产物以及改进封闭式扩增装置。关于封闭式扩增装置的讨论主要围绕单管系统和微流控技术两个方面展开。最后，我们介绍了能够即使在系统中出现非特异性扩增也能给出正确结果的特异性信号诊断技术。通过总结这些策略，本综述为开发高可靠性的基于LAMP的生物传感器奠定了基础，进而推动其在即时检测中的应用。
章节节选
抑制非特异性扩增
非特异性扩增是核酸扩增系统普遍存在的缺陷，它会影响目标序列的合成和检测的准确性[18]。在LAMP技术中出现的非特异性扩增，主要与引物之间的相互作用[19]以及Bst DNA聚合酶的特性[20]有关。具体而言，非特异性扩增的进程如下[14]：（1）BIP发生同源二聚化，从而生成双链扩增产物。
防止气溶胶污染
在LAMP产物扩增后的处理过程中，常常会出现气溶胶污染现象。在打开试管、移液以及转移样品等操作过程中，扩增产物可能会以微观气溶胶滴的形式扩散，从而污染实验室的台面、仪器、试剂或后续的反应混合物。由于LAMP能产生大量扩增产物，且分析灵敏度极高，即使是微量的残留污染物也有可能充当模板。
信号校正
当特异性扩增和非特异性扩增同时存在时，如果发生非特异性扩增，间接检测方法（如浊度法、序列无关嵌入染料法或pH敏感指示剂法）就有可能产生假阳性结果[127]。因此，人们致力于通过目标特异性检测来提高LAMP检测的准确性[128][129]。这类目标特异性检测方法只有在存在目标扩增产物时才会产生信号，而不会在其他情况下发出信号。
结论与展望
要将基于LAMP的生物传感器推向市场应用，面临的最大障碍就是其容易产生假阳性现象，这使得基于LAMP的检测设备的稳定性较差。在本综述中，我们从非特异性扩增抑制、气溶胶污染防止以及错误信号校正三个技术层面，系统总结了防止LAMP出现假阳性的策略。尽管如此，仍有一些挑战需要解决。
首先，虽然引物……
资助情况
本研究得到了生物育种重大项目（编号2022ZD0401901）、中国农业大学生物学青年英才扶持计划（编号BYESS2023265）、中国农业大学“2115”人才发展计划以及北京工商大学食品风味与健康跨创新开放项目的支持。
作者贡献说明
Qi Zhang：可视化分析。Yunbo Luo：项目管理、资金筹集。Nan Cheng：文章撰写与修改、研究指导、项目管理、资金筹集。Fan Zhang：文章撰写与修改、初稿撰写、可视化分析、方法设计、数据分析、概念构建。Xin Wang：文章撰写与修改、初稿撰写、概念构建。Yunyi Li：文章撰写与修改。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
