ZL006-05通过抑制中性粒细胞髓过氧化物酶相关通路，防止脑卒中后tPA诱发的出血性转化

《Stroke and Vascular Neurology》：ZL006-05 prevents tPA-induced haemorrhagic transformation after stroke via inhibiting neutrophil myeloperoxidase-related pathway

　　摘要
背景：出血性转化是急性缺血性中风溶栓治疗中最令人担忧的并发症。本研究旨在探讨一种名为bornyl-2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzyl) aminobenzoate（ZL006-05）的神经保护剂是否可通过影响中性粒细胞髓过氧化物酶活性，预防短暂性中脑动脉阻塞小鼠中重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化。该药物在动物实验中可减轻脑缺血/再灌注损伤，并改善缺血性中风患者的功能预后。

方法：在成年小鼠中建立短暂性中脑动脉阻塞模型。根据110分钟和5小时的中脑动脉阻塞模型，模拟临床治疗窗口内及之外的溶栓再通情况。在给予重组组织型纤溶酶原激活剂之前或之后注射ZL006-05。通过分光光度法检测脑组织中的血红蛋白和埃文斯蓝含量，利用髓过氧化物酶氧化活性测定试剂盒检测MPO活性。通过流式细胞术或免疫荧光法观察中性粒细胞的迁移与浸润情况，用Hoechst染色的DNA定量中性粒细胞外陷阱的形成。使用抗Ly6G mAb克隆1A8清除中性粒细胞，通过Western blot分析检测促炎细胞因子的表达及MPO活性。

结果：ZL006-05能够预防110分钟中脑动脉阻塞小鼠中重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化及血脑屏障损伤，同时降低5小时中脑动脉阻塞小鼠因该药物导致的死亡率。该药物可通过抑制重组组织型纤溶酶原激活剂与高迁移率群蛋白B1结合所引发的中性粒细胞MPO活化，从而防止缺血脑组织中的MPO活化。分子对接分析表明ZL006-05是一种MPO抑制剂，且在纯化的MPO蛋白及培养的炎症细胞中呈剂量依赖性地抑制其酶活性。在MPO缺陷小鼠中，重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化显著减少。此外，ZL006-05还能逆转重组组织型纤溶酶原激活剂引起的中性粒细胞迁移、浸润及中性粒细胞外陷阱的形成。值得注意的是，在MPO基因敲除或中性粒细胞被清除的小鼠中，ZL006-05对重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化的抑制作用消失。另外，ZL006-05能抑制野生型中性粒细胞中的促炎细胞因子表达，但对MPO缺陷中性粒细胞则无此效应。

结论：ZL006-05可通过干扰中性粒细胞MPO的活化，预防重组组织型纤溶酶原激活剂引起的血脑屏障破坏及出血性转化。

相关研究进展：症状性颅内出血是静脉溶栓治疗中极为可怕的并发症。Bornyl-2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzyl) aminobenzoate（ZL006-05）可减轻缺血/再灌注损伤，促进实验性中风模型的功能恢复，在临床试验中也能带来良好的功能预后。

本研究贡献：本研究表明，ZL006-05可通过抑制中性粒细胞及缺血脑组织中的髓过氧化物酶活化，预防重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化及血脑屏障损伤。

研究意义：ZL006-05有望在临床实践中优化溶栓治疗方案。

引言：尽管机械取栓技术有所发展，但对于符合适应症的患者而言，静脉溶栓仍是治疗急性缺血性中风最常用的方法。症状性颅内出血是溶栓治疗中最令人担忧的并发症，它会导致梗死范围扩大并增加死亡率，因而成为重组组织型纤溶酶原激活剂静脉溶栓治疗的主要限制因素。最新研究显示，阿替普酶与经基因改造的tenecteplase在引发症状性颅内出血的风险方面相似。因此，溶栓治疗引发的出血性转化依然是急性缺血性中风治疗面临的难题之一。血脑屏障的破坏是重组组织型纤溶酶原激活剂诱导出血性转化的关键环节。急性缺血性中风发生后，中性粒细胞数量显著增加，同时髓过氧化物酶活性也会大幅上升，这种酶能将过氧化氢和氯离子转化为次氯酸，进而加剧脑组织再灌注损伤。此外，次氯酸还会促使二硫键高迁移率群框1蛋白的转移与分泌，这类危险相关分子模式会引发脑部炎症，进一步破坏血脑屏障。因此，抑制中性粒细胞髓过氧化物酶活性或许能够避免再灌注治疗引发的血脑屏障破坏及出血性转化。有研究指出，一种名为(5-(3,5-dichloro-2-hydroxy benzylamino)-2-hydroxybenzoic acid)（ZL006）的小分子物质可抑制体外人类胚胎肾293T细胞中的MPO活性。ZL006的类似物——bornyl-2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3,5-dichlorobenzyl) aminobenzoate（ZL006-05），可在实验性中风模型中减轻缺血/再灌注损伤并促进功能恢复。极低剂量的ZL006-05经颅内注射在恶性中脑动脉梗死患者中应用安全且有效。一项多中心、随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验表明，静脉注射ZL006-05（40毫克/次）耐受性良好，其功能预后显著优于安慰剂组。目前，针对急性缺血性中风的ZL006-05 III期临床试验已经结束，正在等待在中国获批上市。本研究旨在探讨ZL006-05是否可通过影响中性粒细胞髓过氧化物酶活性，预防中风模型中重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化及血脑屏障破坏。

材料与方法：
动物：本研究使用了成年C57BL/6小鼠以及MPO缺陷小鼠。所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案（IACUC-1812012）进行，并遵循《动物研究：体内实验报告指南》2.0版本的要求，详细内容见在线补充材料。
中风模型、纳入与排除标准、梗死面积及生存曲线测定：采用先前描述的方法建立短暂性中脑动脉阻塞模型。根据预先设定的纳入与排除标准，将动物分组并纳入最终统计分析。梗死面积通过2,3,5-三苯基四唑氯化物染色法测定。各组动物之间的生存曲线比较采用Log-rank检验，具体方法详见先前文献。各组动物分组前的基础神经功能评分见在线补充表S1。样本量、干预后因死亡而排除的动物数量以及终点评估时的动物数量见在线补充表S2，详细内容均在在线补充材料中给出。
药物与给药方式：本研究使用了ZL006-05（Y-3）注射液及重组组织型纤溶酶原激活剂。ZL006-05的剂量为4毫克/千克，这一剂量是根据先前研究确定的，详细信息见在线补充材料。
出血性转化、脑血流及埃文斯蓝染料渗出检测：脑组织中的血红蛋白含量及埃文斯蓝染料渗出量通过分光光度法测定。脑组织出血程度则按照先前描述的方法进行组织学评分。脑血流则通过激光散斑对比成像系统检测，详细内容见在线补充材料。
细胞培养与处理：细胞培养遵循先前描述的方案进行。中性粒细胞的分离也参照先前方法稍作修改后实施。中性粒细胞外陷阱的形成程度同样按先前方法测定。中性粒细胞的清除则使用抗Ly6G mAb克隆1A8，操作方式与先前描述一致。外周血中中性粒细胞CD11b及Ly6G蛋白的表达通过流式细胞术检测，方法也略有调整，详细内容见在线补充材料。
活性氧物种及MPO活性测定：培养的原代中性粒细胞中的活性氧物种生成量通过2’, 7’–二氯荧光素活性氧检测试剂盒测定。细胞或组织中的MPO活性则用髓过氧化物酶氧化活性测定试剂盒检测，详细信息见在线补充材料。
免疫组化与Western blot分析：免疫组化及Western blot分析均按照既定方法进行。

关键资源：抗体、重要商业检测试剂、化学及生化试剂、实验材料以及软件和算法的详细信息见在线补充表S3。

统计学分析：数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行分析，结果以均值±标准差表示，显著性阈值设定为p值<0.05。符合纳入标准的动物被随机分配到不同实验组。样本量是通过“样本量（功效分析与样本大小）”软件计算得出的，设定显著性水平为α=0.05，要求研究具有90%的功效。所有实验均在盲法条件下进行，详细内容见在线补充材料。

结果：
ZL006-05预处理可预防重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化及血脑屏障破坏：实验方案如图1A所示，重组组织型纤溶酶原激活剂的剂量是根据先前研究确定的。110分钟的中脑动脉阻塞模型（模拟治疗窗口内的再通情况）会导致同侧脑组织出现明显的埃文斯蓝染料渗出，同时Zonula occludens-1及occludin蛋白的表达水平下降，这些变化均表明存在血脑屏障损伤。与单纯缺血/再灌注模型相比，重组组织型纤溶酶原激活剂会造成更严重的血脑屏障损伤。ZL006-05不仅比对照组更能减轻缺血/再灌注模型引起的埃文斯蓝染料渗出以及Zonula occludens-1和occludin蛋白表达下降，还能阻止重组组织型纤溶酶原激活剂带来的血脑屏障损伤进一步恶化（图1B–F）。此外，重组组织型纤溶酶原激活剂会显著加重缺血/再灌注模型导致同侧脑组织中的血红蛋白含量升高，而ZL006-05预处理可消除重组组织型纤溶酶原激活剂的这种有害作用（图1G,H）。我们还在雌性小鼠中测试了ZL006-05对重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化及血脑屏障破坏的影响，结果与雄性小鼠相似（见在线补充图S1）。总体而言，只要在临床治疗窗口内使用，ZL006-05即可预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的血脑屏障破坏及出血性转化。
为探究ZL006-05是否能在重组组织型纤溶酶原激活剂的最佳治疗窗口之外仍具有防护作用，我们让小鼠接受了更接近人类恶性中脑动脉梗死的5小时中脑动脉阻塞处理，实验方案如图2A所示。激光散斑对比成像结果显示，血管堵塞解除2小时后脑血流量已开始恢复（图2B,C）。再灌注48小时后，对照组和重组组织型纤溶酶原激活剂组的死亡动物比例分别超过60%和80%。在重组组织型纤溶酶原激活剂组中，超过70%的动物在用药后3小时内死亡。而在再灌注前20分钟给予ZL006-05预处理后，动物的累积生存率明显高于对照组和仅使用重组组织型纤溶酶原激活剂组，且其终点死亡率也显著低于重组组织型纤溶酶原激活剂组（图2D,E）。此外，重组组织型纤溶酶原激活剂与ZL006-05联合使用还能显著缩小梗死体积，优于单独使用重组组织型纤溶酶原激活剂组（图2F）。由于重组组织型纤溶酶原激活剂组存活的动物数量较少，无法在终点时检测血红蛋白和埃文斯蓝的含量。因此，我们在重组组织型纤溶酶原激活剂给药2小时后，观察了ZL006-05是否能预防5小时中脑动脉阻塞小鼠的出血性转化。给药2小时内，重组组织型纤溶酶原激活剂组的五只小鼠中有四只死亡，且存在大血管出血及脑实质出血现象；而重组组织型纤溶酶原激活剂+ZL006-05组的动物均无死亡，也没有明显的大血管出血，其出血评分也显著降低（图2G,H）。另外，ZL006-05还能显著降低持续48小时的中脑动脉永久性阻塞小鼠的死亡率和梗死体积（见在线补充图S2）。由于5小时中脑动脉阻塞小鼠的死亡率远高于持续中脑动脉阻塞小鼠，尤其是在中风后12小时内（图2D与在线补充图S2A对比），因此对于恶性中风而言，延迟再灌注可能会带来不良后果。
延迟使用ZL006-05可逆转重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的出血性转化及血脑屏障破坏：为探究延迟使用ZL006-05是否能否减轻重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化，我们在重组组织型纤溶酶原激活剂给药后再给予ZL006-05（图3A）。重组组织型纤溶酶原激活剂会进一步加重缺血/再灌注模型导致同侧脑组织中埃文斯蓝染料含量升高以及Zonula occludens-1和occludin蛋白表达下降的情况，而ZL006-05则可以逆转这些由重组组织型纤溶酶原激活剂引发的变化（图3B–F）。此外，重组组织型纤溶酶原激活剂与ZL006-05联合使用还能显著降低缺血/再灌注模型导致的埃文斯蓝染料含量上升，这说明ZL006-05具有保护血脑屏障的作用。重组组织型纤溶酶原激活剂还会加重缺血/再灌注模型导致同侧脑组织中血红蛋白含量升高，ZL006-05则可消除重组组织型纤溶酶原激活剂的这种有害影响（图3G,H）。为直观观察出血性转化情况，我们测定了同侧脑半球的整体出血评分。与血红蛋白含量类似，重组组织型纤溶酶原激活剂处理组小鼠的出血评分约为对照组的三倍，而ZL006-05则完全消除了重组组织型纤溶酶原激活剂带来的这一效应（见在线补充图S3）。另外，延迟使用ZL006-05还能显著降低缺血/再灌注模型导致同侧脑半球血红蛋白含量上升的趋势（见在线补充图S4A–C）。这些结果表明，ZL006-05既能预防缺血/再灌注模型引发的出血性转化，也能预防重组组织型纤溶酶原激活剂引发的出血性转化。此外，在重组组织型纤溶酶原激活剂给药后使用ZL006-05，还可逆转该药物导致的梗死体积扩大现象（图3I, J）。接下来，我们分析了动物的神经功能评分及生存率（图3K）。与仅使用重组组织型纤溶酶原激活剂组相比，ZL006-05预处理组在中风后5天的神经功能评分显著更低。ZL006-05与重组组织型纤溶酶原激活剂联合处理组的神经功能评分也有下降趋势，但差异无统计学意义（图3L）。中风后8天时，ZL006-05与重组组织型纤溶酶原激活剂联合处理组的动物生存率显著高于仅使用重组组织型纤溶酶原激活剂组，且其累积生存曲线也明显优于对照组（图3M）。
ZL006-05可预防重组组织型纤溶酶原激活剂诱导的MPO活化：中性粒细胞的迁移是重组组织型纤溶酶原激活剂引发出血性转化的潜在机制之一。中性粒细胞产生的MPO是形成中性粒细胞外陷阱的必需成分。为验证重组组织型纤溶酶原激活剂是否会激活中性粒细胞中的MPO，我们将原代中性粒细胞与重组组织型纤溶酶原激活剂一同培养，培养过程中加入2%的假手术组或110分钟中脑动脉阻塞组小鼠的血清，培养时间为2小时。rtPA与来自tMCAO小鼠的2%血清联合使用，而并非来自假手术小鼠的血清，显著增强了中性粒细胞的MPO活性（图4A），这表明“缺血血清”是rtPA诱导MPO激活所必需的。ZL006-05可呈剂量依赖性地抑制rtPA与“缺血血清”联合使用所引发的MPO激活（图4B）。HMGB1参与了rtPA诱导的HT现象。8 25 我们检测了tMCAO后小鼠外周血中的HMGB1水平（图4C），发现缺血/再灌注显著提升了HMGB1的水平，rtPA进一步放大了缺血/再灌注对HMGB1的影响，而ZL006-05则能阻止rtPA促进HMGB1的产生（图4D）。接着，我们在含有1?μg/mL HMGB1的条件下，用rtPA处理培养的中性粒细胞2小时。rtPA与HMGB1的结合显著提高了培养中性粒细胞中的MPO活性，这说明升高的HMGB1可能解释了“缺血血清”与rtPA共同诱导MPO活性的机制。ZL006-05同样呈剂量依赖性地抑制了rtPA+HMGB1诱导的MPO激活（图4E）。随后，我们检测了tMCAO后24小时同侧大脑中的MPO活性（图4C）。预先使用ZL006-05不仅能够抑制缺血/再灌注引起的MPO活性上升，还能阻止rtPA进一步加剧缺血/再灌注导致的MPO活性升高（图4F）。与预先处理类似，rtPA处理后再使用ZL006-05也能阻断rtPA对MPO的作用（图4G,H）。此外，在再灌注后使用ZL006-05也能降低缺血/再灌注引起的MPO活性上升（在线补充图S4A, D）。这些结果表明，ZL006-05能够抑制缺血脑组织中由缺血/再灌注或rtPA引发的MPO激活。重要的是，与野生型小鼠相比，MPO基因敲除小鼠的rtPA诱导的HT现象显著减轻，且延迟使用ZL006-05也不会影响MPO?/?小鼠的rtPA诱导HT情况（图4I），这说明ZL006-05是通过干扰MPO激活来预防rtPA诱导的HT的。另外，使用四肽抑制剂P5779阻断HMGB1与Toll样受体4（TLR4）之间的相互作用，26也能消除HMGB1+rtPA对中性粒细胞中MPO激活的促进作用（图4F），表明TLR4信号通路在HMGB1+rtPA诱导MPO激活过程中起着关键作用。活化的MPO会产生活性氧27。我们发现ZL006-05能以浓度依赖的方式抑制佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）诱导的中性粒细胞活性氧生成（在线补充图S5）。此外，rtPA会加剧缺血/再灌注导致的MPO蛋白水平上升，而在rtPA处理前后使用ZL006-05都能阻断rtPA对MPO表达的影响（在线补充图S6）。ZL006-05能够抑制MPO蛋白以及培养的炎症细胞中的MPO酶活性。为确定ZL006-05是否直接抑制MPO的酶活性，我们将ZL006-05与MPO的活性位点结构进行对接（蛋白质数据库编号：4c1m）。28 ZL006-05中的3,5-二氯-2-羟基苄胺部分结合在MPO血红素口袋的入口处，2-降冰片醇部分朝向MPO表面延伸，而3,5-二氯-2-羟基苄胺的苯环则几乎与血红素的吡咯环平行，使得血红素的苯环与吡咯环之间形成较强的π?π相互作用。此外，羟基上的氧原子位置恰好可以与Asp239的羧基形成氢键。氯原子则能与Gln91的侧链形成较弱的氢键。同时，中间苯环上的羟基也会与血红素的羧酸基团形成氢键。两个苯环之间的连接键上的-NH-则可以与Glu102的羧酸基团以及血红素形成三个盐桥。2-降冰片醇部分则占据了由Phe366和Phe407在活性位点入口处形成的疏水腔体。根据对接复合物的结合情况推测，ZL006-05可能是MPO的可逆抑制剂（图5A）。接下来，我们检测了ZL006-05是否会影响纯化后的MPO蛋白的酶活性，结果发现ZL006-05能以浓度依赖的方式抑制MPO活性（图5B, C）。MPO的活性可能会因其在细胞内与其他分子的结合而发生变化29。因此，我们在用PMA刺激0.5小时后的培养初级中性粒细胞，以及用脂多糖（LPS）刺激18小时的BV2小胶质细胞和Ana-1巨噬细胞中检测了MPO的酶活性。结果发现ZL006-05同样以浓度依赖的方式抑制MPO酶活性，且其抑制效果比在纯化MPO蛋白中更为显著（图5D–F）。尤其是在中性粒细胞和BV2细胞中，低至10?nM的浓度就能显著抑制MPO活性（图5D,E）。ZL006-05能够防止rtPA诱导的中性粒细胞动员、募集以及NETs的形成。我们对经过110分钟tMCAO处理的小鼠同时给予rtPA和ZL006-05处理，然后通过流式细胞术分析外周白细胞中的中性粒细胞比例（图6A）。缺血/再灌注会显著增强中性粒细胞的动员，rtPA则会进一步加剧这种动员效应，而预先使用ZL006-05则能显著降低缺血/再灌注引发的中性粒细胞动员，并阻止rtPA进一步加重这一现象（图6B,C）。此外，无论是110分钟还是300分钟的tMCAO处理，都会导致大量中性粒细胞聚集到缺血脑组织中，尤其是300分钟tMCAO组更为明显。在最佳治疗窗口内外使用rtPA都会加剧缺血/再灌注导致的中性粒细胞向缺血脑组织的募集，而预先使用ZL006-05则能阻止rtPA带来的这种中性粒细胞募集加剧现象（在线补充图S7）。总体而言，ZL006-05能够抑制在最佳治疗窗口内外由缺血/再灌注及rtPA引发的中性粒细胞动员与募集现象。为确定ZL006-05是否能够阻止rtPA诱导的NETs形成，我们让中性粒细胞与rtPA共同孵育8小时以诱导NETs的形成。正如预期，rtPA会显著促进NETs的形成，而ZL006-05则能显著减少rtPA诱导的NETs数量（图6D）。接着，我们研究了ZL006-05是否能在缺血脑组织中阻止rtPA诱导的NETs形成。实验所用的tMCAO模型及处理方式与图6A相同。缺血/再灌注会显著增加同侧脑组织中Ly6G+/H3cit+细胞的数量，这表明NETs正在形成。rtPA会使缺血/再灌注导致的Ly6G+/H3cit+细胞数量增加约两倍，而ZL006-05则能阻止rtPA对这类细胞的影响（图6E）。综合来看，ZL006-05能够在体外培养的中性粒细胞以及缺血脑组织中阻止rtPA诱导的NETs形成。为确定ZL006-05是否通过靶向中性粒细胞来预防rtPA诱导的HT，我们在tMCAO处理前的72小时、48小时、24小时以及0小时分别给小鼠注射抗Ly6G抗体，以此清除中性粒细胞（图6F）。这种处理几乎完全清除了外周血液中的中性粒细胞（图6G）。在清除中性粒细胞后，rtPA组与ZL006?05+rtPA组之间缺血脑组织的血红蛋白水平没有显著差异（p>0.05），这说明ZL006-05确实是通过靶向中性粒细胞来预防rtPA诱导的HT的。ZL006-05能够抑制神经炎症反应。为确定ZL006-05是否能够抑制促炎细胞因子的表达，我们让培养的初级中性粒细胞与LPS/干扰素-γ（IFN-γ）共同孵育3小时，以激发炎症反应。预先使用ZL006-05能显著降低白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平（图7A–C）。此外，我们还让MPO?/?小鼠和野生型小鼠的中性粒细胞与LPS/IFN-γ共同孵育3小时，结果发现ZL006-05仅能抑制MPO+/+中性粒细胞中的IL-1β表达，而对MPO?/?中性粒细胞则无此效果（图7D）。接着，我们对经过110分钟tMCAO处理的小鼠，在tMCAO处理后12小时立即静脉注射4mg/kg的ZL006-05，然后在tMCAO处理后24小时检测了同侧脑组织中可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）、IL-1β和TNF-ɑ的含量（图7E）。110分钟的tMCAO处理会显著提升iNOS、IL-1β和TNF-ɑ的表达水平，而ZL006-05则完全逆转了tMCAO引发的这些促炎因子的表达升高趋势（图7F–I）。综上所述，ZL006-05是通过干扰MPO的激活来抑制缺血/再灌注引发的神经炎症反应的。讨论HT是急性缺血性卒中患者接受溶栓治疗时最令人担忧的并发症1 2。本研究显示，无论在临床治疗窗口范围内还是之外使用rtPA，ZL006-05都能有效预防由其引发的HT。该药物能够抑制或逆转rtPA在中性粒细胞以及缺血/再灌注脑组织中引发的MPO激活，同时还能阻止rtPA导致的中性粒细胞动员、募集以及NETs的形成。此外，ZL006-05还能抑制纯化后的MPO蛋白以及培养的炎症细胞中的MPO酶活性。尤为重要的是，通过敲除MPO基因或清除血液中的中性粒细胞，ZL006-05对rtPA诱导HT的抑制效果就会消失，这说明ZL006-05很可能是通过抑制中性粒细胞的MPO激活来预防rtPA诱导的HT的。中性粒细胞的活化与脱颗粒是促使MPO生成的重要机制，也是血浆中MPO的来源30。MPO会产生HOCl及其他氯化物质，进而引发炎症和氧化应激，而这些因素又是NETs形成的必要条件7 24 31。急性缺血性卒中发生后，中性粒细胞数量大幅增加，同时MPO的生成量也会显著上升7 8。再灌注处理还会进一步加剧MPO的活化32。我们发现，rtPA诱导中性粒细胞MPO活化需要HMGB1的协同作用，HMGB1是一种在血清中大量产生并积累的DAMP分子，与卒中后rtPA诱导的HT现象密切相关25。HMGB1可通过TLR4信号通路引发炎症反应26，而这一通路也与中性粒细胞MPO活化以及rtPA诱导的HT有关33 34。我们发现，阻断HMGB1与TLR4之间的相互作用，就能减弱HMGB1+rtPA对MPO的活化作用，因此HMGB1-TLR4信号通路很可能在rtPA诱导MPO活化过程中发挥作用。活化的中性粒细胞MPO会产生活性氧7 8 31，而中性粒细胞内的活性氧又会进一步促使MPO释放以及NETs的形成27 35。活性氧不仅对HMGB1从细胞核中释放出来起着关键作用，还决定了细胞外HMGB1的生物活性，因为活性氧能够促使HMGB1形成分子内的二硫键，这种结构变化有助于促进中性粒细胞活化及NETs形成8 36。rtPA可直接或间接产生大量活性氧37，因此活性氧-HMGB1-MPO-活性氧循环很可能参与了rtPA诱导的HT过程。在本研究中，ZL006-05不仅直接抑制了MPO的活化，还抑制了活化中性粒细胞中的活性氧生成，因此它有可能打破活性氧-HMGB1-MPO-活性氧循环，从而预防rtPA诱导的HT。中性粒细胞的募集、活化以及NETs的形成，是tPA诱导的脑血屏障损伤及缺血脑组织中HT现象背后的重要机制15 23 38。我们发现ZL006-05能够阻止rtPA诱导的中性粒细胞向缺血脑组织中的动员、募集以及NETs的形成。更为重要的是，清除中性粒细胞后，ZL006-05对rtPA诱导HT的抑制效果就会消失，这说明ZL006-05很可能是通过靶向中性粒细胞来预防rtPA诱导的HT的。酶促型的MPO/HOCl系统与基质金属蛋白酶2/9（MMP2/9）的表达及活性密切相关39 40，而这两种酶在卒中后脑血屏障破坏过程中起着至关重要的作用6。此外，rtPA还会增强MMP2/9对脑血屏障的促炎作用6。因此，我们不能排除ZL006-05也可能通过影响MMP2/9来抑制rtPA诱导的脑血屏障损伤的可能性。另外，rtPA还能通过调节N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）来引发神经毒性22 41。中性粒细胞表面表达有NMDAR42，而ZL006-05能够阻断NMDAR的下游信号传导，进而抑制PSD-95与nNOS之间的相互作用9 11。不过，由于中性粒细胞中不存在PSD-95与nNOS的相互作用，因此ZL006-05无法通过阻断这一途径来抑制rtPA诱导的中性粒细胞MPO活化。ZL006-05是一种α2亚型GABA_A受体的正向别构调节剂11。但由于中性粒细胞中缺乏具有功能的GABA_A受体43，ZL006-05也无法通过激活GABA_A受体来抑制rtPA诱导的中性粒细胞MPO活化。此外，我们发现5小时tMCAO处理所导致的中性粒细胞向脑组织的募集程度要高于110分钟tMCAO处理的情况，这一差异或许可以解释为何在超出临床治疗窗口范围使用rtPA会导致大多数动物死亡。除了中性粒细胞外，巨噬细胞和小胶质细胞中也表达有MPO31。在本研究中，tMCAO处理后24小时测得的脑组织中MPO水平显著升高，这一现象很可能是由中性粒细胞产生的，因为中性粒细胞中的MPO活性在卒中发生后的1–3天达到峰值，而巨噬细胞/小胶质细胞中的MPO活性则在5–7天达到高峰44。此外，在清除中性粒细胞后，ZL006-05对rtPA诱导HT的保护作用也会消失（图6H）。因此，在tMCAO处理后24小时，与HT相关的脑组织MPO活性升高很可能主要来自中性粒细胞。当然，我们也不能排除脑组织中MPO活性升高部分是由于MPO基因表达上调所致，因为rtPA确实会加剧缺血/再灌注导致的MPO蛋白水平上升（在线补充图S6）。局限性在本研究中，我们采用了tMCAO模型而非栓塞性大脑中动脉闭塞模型来研究ZL006-05对rtPA诱导HT的保护作用。虽然tMCAO模型能够避免干扰与rtPA溶栓治疗相关的血液学变化，但它可能与栓塞性大脑中动脉闭塞模型在炎症反应方面存在显著差异。此外，我们的研究仅在一次实验中探讨了ZL006-05对雌性小鼠中rtPA诱导HT的影响，未来研究中有必要系统地评估不同性别小鼠在使用ZL006-05时的差异表现。此外，通过分子对接预测的ZL006-05与MPO活性位点之间的相互作用，仍需未来通过对蛋白质和药物分子共晶体的冷冻电子显微镜分析来从结构上加以确认。另外，本研究通过检测伊文斯蓝外渗情况以及紧密连接蛋白的表达来评估血脑屏障功能，但为了阐明其内在机制，仍需要采用更直接或更高分辨率的评估方法，如双光子显微镜或透射电子显微镜分析，以及检测紧密连接蛋白与内皮标志物的共定位。

结论：rtPA通过HMGB1-TLR4通路激活中性粒细胞中的MPO，进而导致中性粒细胞的动员、浸润以及NET的形成，最终造成血脑屏障损伤并引发高血压。ZL006-05通过干扰中性粒细胞MPO的激活，从而预防由tPA引起的高血压。

作者贡献：WC：撰写——初稿、方法学、研究实施、正式分析、数据整理、概念设计。HW：方法学、研究实施、数据整理、验证、监督、概念设计。XX：方法学、正式分析、数据整理。Y-JQ：方法学、研究实施。LZ：撰写——初稿、方法学。DZ：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资金获取、概念设计。DZ为项目负责人。

资金支持：本研究得到了中国国家自然科学基金（82090042）、中国国家重点研发计划（2021YFA1101803）以及中国STI2030重大专项（2022ZD0211703）的资助。

利益冲突：无。

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