用18F-UCB-F显像突触囊泡蛋白SV2C：体外放射自显影与非人灵长类活体PET研究

《ACS Chemical Neuroscience》：Imaging Synaptic Vesicle Protein SV2C with 18F-UCB-F: An In Vitro Autoradiography and In Vivo NHP PET Study

　　

突触囊泡蛋白SV2C主要分布于基底节区，遗传学研究提示其与帕金森病（PD）相关，在调节多巴胺释放中起关键作用，PD动物模型及患者脑组织中SV2C表达发生紊乱。在PD相关突触病变背景下，SV2C可作为监测疾病进展及治疗反应的潜在显像靶点。18F标记配体[18F]UCB-F是UCB公司开发的SV2C结合放射性配体；大鼠初步放射自显影及PET研究表明[18F]UCB-F脑分布与SV2C表达一致但活体未见特异性结合。本研究旨在进一步探究[18F]UCB-F对SV2C的亲和力与选择性，并在非人灵长类（NHP）中考察其体外放射自显影及活体PET性质。研究人员通过体外结合实验测定UCB-F对SV2A、SV2B及SV2C的亲和力，采用计算机模拟（in-silico modeling）评估结合模式与结合能；对大鼠及NHP脑切片行放射自显影确认[18F]UCB-F在大鼠与NHP组织中的分布相似性；对NHP行PET检查以评价[18F]UCB-F活体药代动力学特征。[18F]UCB-F由相应前体经高产率合成。大鼠及NHP脑切片放射自显影显示[18F]UCB-F在苍白球、纹状体、黑质及脑干存在特异性结合，与已知SV2C脑内表达相符。NHP中[18F]UCB-F迅速透过血脑屏障，注射后4 min达峰摄取值分别为NHP1的2.8%ID与NHP2的2.1%ID；示踪剂快速从脑洗脱，无清晰区域分布差异。放射代谢物分析显示仅生成极性更强放射代谢物，注射后15 min血浆中约剩15%原形放射配体。体外及计算机模拟研究表明，温度从277 K（4 ℃）升至310 K（37 ℃）时[18F]UCB-F对SV2C亲和力下降约一个数量级；该温度相关的SV2C亲和力降低伴随快速的活体放射代谢可能是[18F]UCB-F体外与活体表现不一致的原因。综上，[18F]UCB-F不适合作为SV2C显像的PET放射性配体，需进一步研发具有更好活体稳定性及脑滞留能力的替代候选分子。

论文解读：用¹⁸F-UCB-F显像突触囊泡蛋白SV2C——体外放射自显影与非人灵长类活体PET研究

本文发表于《ACS Chemical Neuroscience》。突触囊泡糖蛋白2C（synaptic vesicle glycoprotein 2C, SV2C）是SV2家族成员，选择性富集于基底节区（尾状核、壳核、苍白球、黑质）的多巴胺能及GABA能神经元，参与囊泡转运及神经递质释放调控；动物实验及PD患者脑组织均显示SV2C表达下调或功能紊乱与帕金森病（Parkinson's disease, PD）相关，因此被认为是PD突触早期病变及病程监测的潜在正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）靶点。目前已临床应用的SV2A PET示踪剂如[¹¹C]UCB-J和[¹⁸F]SynVesT-1在全脑广泛分布，纵向检测中对突触密度变化不够敏感，难以反映疾病进展。而UCB公司前期开发的SV2C靶向放射配体[¹⁸F]UCB-F在大鼠离体放射自显影（autoradiography, ARG）中与SV2C分布吻合，但活体大鼠PET未见特异性结合，其非人灵长类（nonhuman primate, NHP）性质尚未明确。为此研究人员开展本研究，系统评价[¹⁸F]UCB-F对SV2亚型的体外亲和力与选择性、大鼠及NHP脑片特异性结合情况，以及NHP活体PET药代与血浆代谢特征，最终判定其是否适合作为SV2C PET示踪剂并探讨体外与活体结果差异的机制。

主要关键技术方法

研究人员以SV2A（PDB ID: 8UO9）为模板通过同源建模构建SV2C三维结构，将UCB-F对接后于POPC脂质双层中进行100 ns分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟（277 K、294 K、310 K各三复孔），分析结合构象稳定性及氢键寿命。采用竞争结合实验测定UCB-F对人源（h）SV2C、SV2A、SV2B及大鼠（r）/猪（p）SV2C在4 ℃（277 K）与37 ℃（310 K）下的pKi值。以¹⁸O(p,n)¹⁸F反应制备[¹⁸F]F^?，与甲磺酸酯前体亲核取代合成并HPLC纯化[¹⁸F]UCB-F（放射化学产率＞35%，放化纯度＞99%）。取Sprague–Dawley大鼠（n=3）及食蟹猴（Macaca fascicularis, NHP, n=2）冰冻脑切片行ARG，总结合与加10 μM冷UCB-F非特异结合对照计算特异性结合。两只雄性食蟹猴行基线[¹⁸F]UCB-F PET扫描（列表模式采集123 min），手动勾画尾状核、壳核、苍白球、黑质及小脑体积感兴趣区（volume of interest, VOI）提取时间–活度曲线（time–activity curve, TAC），以标准化摄取值（standardized uptake value, SUV）表示。各时点采集静脉血，沉淀蛋白后HPLC分析原形放射配体与放射代谢物比例。

Results and Discussions

In Silico Modeling

研究人员通过同源建模获得SV2C–UCB-F复合物结构，发现UCB-F在SV2C结合口袋中以两个关键氢键稳定锚定。100 ns MD模拟中配体均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）＜2.5 ?，表明结合构象稳定。进一步分析氢键寿命发现其中一个氢键随温度升高明显缩短：277 K时平均寿命11.86 ns，310 K时降至1.03 ns。计算机模拟提示升温削弱氢键稳定性，可导致配体–蛋白相互作用减弱，与实验观察到的温度依赖性亲和力下降相吻合。

In Vitro Competition Studies

竞争结合实验显示UCB-F对hSV2C的pKi在277 K为8.3±0.06，310 K降至7.3±0.21（人）、6.9±0.13（大鼠）、7.0±0.06（猪）；310 K时对hSV2A与hSV2B的pKi＜6（无可测结合），SV2C对SV2A/SV2B选择性达20–200倍。低温（4 ℃）人为抬高表观亲和力，生理温度下UCB-F仍保持对SV2C的选择性结合（低至中十位纳摩尔级）。

Radiolabeling of [¹⁸F]UCB-F

以甲磺酸酯为前体，K_2.2.2/K₂CO₃催化¹⁸F亲核取代，乙腈作溶剂、100 ℃反应10 min为最优条件，放射化学产率（非衰变校正）＞35%，放化纯度＞99%，全程≤75 min完成。

Autoradiography Studies in Rat and Nonhuman Primate Brain Tissue

大鼠及NHP脑片ARG显示[¹⁸F]UCB-F结合呈SV2C典型分布——脑干、深部小脑核团（deep cerebellar nuclei, DCN）、纹状体、苍白球及黑质结合最高，皮层及海马最低。加大剂量冷UCB-F后高表达区仅余＜10%（大鼠）或～20%（NHP）非特异性结合，证实体外特异性结合。NHP切片略高非特异性结合归因于切片较厚（20 μm vs 大鼠12 μm）。

PET Studies with [¹⁸F]UCB-F in Nonhuman Primates

两只NHP注射[¹⁸F]UCB-F后全脑快速摄取（NHP1峰值SUV 3.4，NHP2为3.0），注射后4 min达峰（分别为2.8%ID与2.1%ID），但各脑区间SUV差异极小，随即从全脑快速洗脱，时间–活度曲线无SV2C高表达区滞留特征，活体未见区域特异性结合。

Radiometabolite Analysis

血浆HPLC显示注射后2 min原形放射配体占～92%，15 min降至～15%，45 min约22%；代谢产物极性更大。提示[¹⁸F]UCB-F在体内快速代谢，晚期血浆原形分数低，影响有效脑递送及输入函数准确性。

讨论与结论总结

研究人员得出结论：[¹⁸F]UCB-F可经¹⁸F亲核取代高效合成，离体脑片放射自显影证实其对SV2C富集区具特异性结合；但在NHP活体PET中呈现快速血脑屏障通透、全脑均一快速洗脱且无区域分布差异，并伴有血浆中快速代谢降解。体外结合实验与计算机模拟共同表明，生理温度（37 ℃）相较低温（4 ℃）使[¹⁸F]UCB-F对SV2C亲和力下降约一个数量级（氢键稳定性降低所致），叠加快速的体内放射代谢，解释了离体与活体表现的不一致。综合上述结果，[¹⁸F]UCB-F不适合作为体内SV2C显像PET放射性配体，后续需开发体内更稳定、脑滞留更强的SV2C靶向候选分子。