针对HPV16生物标志物E6的新型DNA适配体筛选：计算机模拟方法

《ACS Omega》：Selection of Novel DNA Aptamers against HPV16 Biomarker, E6: An In Silico Approach

　　

HPV16 E6癌蛋白是宫颈癌发生发展的关键驱动因子，亟需高特异性的诊断与治疗试剂。本研究通过结构导向的虚拟筛选及250 ns分子动力学（MD）模拟流程，进行靶向HPV16 E6癌蛋白的DNA适配体的计算机模拟筛选，模拟使用GROMACS 2019软件包及CHARMM36M力场完成。研究人员利用AutoDock VinaXB和HADDOCK软件对八个候选适配体进行评估，并以F2 RNA适配体为基准对照。MM/PBSA（分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积法）计算识别Apt 9（?143.76 kcal/mol）为最具潜力的先导化合物，其亲和力超过F2对照（?142.80 kcal/mol）。Apt 8作为关键共识先导化合物，表现出优异的结构稳定性（RMSD 0.23 nm）及 strongest interaction network（11.49个氢键）。值得注意的是，这些先导化合物主要靶向E6蛋白上的关键组氨酸残基（His78、His118和His126）。上述结果将Apt 9和Apt 8指定为高优先级候选物，用于实验验证，为新型HPV16靶向干预措施提供了坚实的理论基础。

本研究聚焦于人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6癌蛋白靶向DNA适配体的计算机模拟筛选，旨在为宫颈癌等HPV16相关恶性肿瘤的诊断与治疗提供新型分子工具。研究背景方面，HPV16是全球范围内宫颈癌、口咽癌、肛门癌及多种生殖器恶性肿瘤的主要致病因子，尽管广泛接种预防性疫苗，但现有治疗方案仍局限于感染后病变管理与癌症治疗，缺乏针对病毒本身的直接抗病毒手段。E6与E7两种癌蛋白对维持HPV阳性肿瘤的恶性状态不可或缺，其中E6通过泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）介导肿瘤抑制蛋白p53的降解，并激活端粒酶（telomerase），从而导致细胞永生化、DNA损伤累积及癌症发展。相较于主要作用于癌变早期阶段的E7蛋白，E6因其持续的致癌活性及明确的可成药结合界面（如E6AP结合口袋），成为更优的配体靶向策略靶点。适配体（aptamers）作为单链寡核苷酸，能够折叠形成复杂三维结构，以高亲和力和特异性识别蛋白质、肽段、碳水化合物乃至完整细胞等多种靶标，具有合成便捷、易于修饰、热力学稳定性高、免疫原性低及肿瘤核心穿透能力强等优势，在靶向药物递送、分子成像及即时诊断平台中展现出广阔应用前景。尽管适配体技术在HPV16诊疗中潜力巨大，但高效理性的设计策略至关重要；计算机模拟方法如分子对接与分子动力学模拟为预测适配体-靶标相互作用、筛选候选序列及优化结合特性提供了强有力且经济高效的工具。

研究人员开展了针对HPV16 E6癌蛋白的DNA适配体计算机模拟筛选研究。首先，从蛋白质数据库（RCSB PDB）获取E6蛋白结构（PDB ID: 4XR8），该结构捕获了E6-E6AP-p53三元复合物，直接针对E6的致癌机制。通过SAVES服务器（ERRAT、WHATCHECK、PROCHECK）及Swiss model-QMEAN服务器对蛋白结构进行验证与优化，确保后续分析的可靠性。利用DogSite Scorer工具预测结合口袋，确定P_0口袋具有最优的适配体结合特性（DrugScore 0.79，体积578.11 ?³）。通过AutoDock VinaXB进行虚拟筛选，并以HADDOCK服务器进行精细化分子对接，设计了八个候选适配体（Apt1-Apt9，其中Apt4因无法获得可靠三维结构而被排除），同时引入文献报道的F2 RNA适配体作为阳性对照。对筛选出的复合物进行250 ns分子动力学模拟，运用GROMACS 2019软件包及CHARMM36M力场，在显式TIP3P水分子环境中分析其结构稳定性与动力学行为。通过MM/PBSA方法计算结合自由能，并以主成分分析（PCA）评估构象动态特征。

研究结果表明，各候选适配体与E6蛋白形成稳定的相互作用复合物。分子动力学分析显示，Apt8和Apt9在结构稳定性方面显著优于F2对照：Apt9维持高度一致的主链构象（RMSD 0.23 ± 0.03 nm，95%置信区间0.23–0.23 nm），Apt8同样达到0.23 nm的RMSD水平；而F2对照的RMSD高达0.94 ± 0.19 nm，表明其构象灵活性显著更大。在回转半径（Rg）方面，Apt8复合物达到最高程度的压缩（1.46 ± 0.02 nm），显著低于Apt1和Apt2的值，证实E6蛋白在结合后维持紧密的球状折叠。溶剂可及表面积（SASA）分析显示，Apt8将蛋白SASA降至96.41 ± 2.05 nm²，远低于游离蛋白（115.13 ± 1.84 nm²），提示其有效占据了E6蛋白表面大片区域，潜在屏蔽关键结合基序。氢键分析进一步揭示Apt8维持最 robust 的相互作用网络，平均形成11.49 ± 2.35个氢键（95%置信区间11.42–11.56），显著优于F2对照（8.59 ± 1.94）及其他候选物如Apt1（7.36 ± 1.94）。

MM/PBSA结合自由能分析确定了各候选适配体的亲和力排序。Apt9以?143.76 kcal/mol的结合自由能成为最优先导化合物，超越了F2对照的?142.80 kcal/mol；紧随其后的是Apt7（?138.71 kcal/mol）、Apt1（?138.26 kcal/mol）、Apt5（?137.76 kcal/mol）和Apt8（?136.43 kcal/mol）。能量组分分析显示，范德华相互作用（E_vdw）在Apt5（?89.31 kcal/mol）、Apt8（?81.59 kcal/mol）和Apt1（?77.40 kcal/mol）中最为有利，反映其良好的空间互补性与紧密堆积；静电相互作用（E_elec）是所有适配体结合的主要驱动力，范围达?3035.04至?3513.40 kcal/mol，其中Apt5（?3513.40 kcal/mol）、Apt1（?3486.85 kcal/mol）和Apt7（?3470.27 kcal/mol）表现最为突出；极性溶剂化能（ΔE_PB）呈较大正值（3039.50–3523.73 kcal/mol），与有利的静电相互作用近乎抵消，这是水溶液体系的典型特征；非极性溶剂化能（ΔE_NPOLAR）则对所有适配体均为有利贡献（?34.74至?58.78 kcal/mol），表明疏水效应在稳定复合物中具有重要作用。

主成分分析揭示了各适配体-蛋白复合物的构象动态特征。Apt8表现出最集中的点簇分布，与其低RMSD值高度一致；F2对照占据显著更大的区域，证实其更高的灵活性。Apt6和Apt8维持紧密、局域化的点簇，提示其刚性结构核心及有限的构象采样；而Apt7和Apt5呈现广泛分散的分布，表明这些候选物在该坐标空间中具有高度灵活性，采样多种不同结构状态。

研究结论部分指出，本研究建立了针对HPV16 E6癌蛋白的DNA适配体筛选 streamlined 计算流程，整合虚拟筛选与250 ns分子动力学模拟。通过八个候选物与F2 RNA基准的评估，识别Apt9为最具潜力的先导化合物，实现?143.76 kcal/mol的结合自由能，超越?142.80 kcal/mol的阳性对照；结构分析优先确定Apt9与Apt8为最稳定的复合物，两者均维持0.23 nm的最小RMSD。Apt8进一步以最强氢键网络（11.49个氢键）脱颖而出，显著优于F2对照。机制上，这些适配体靶向4XR8蛋白模型中的关键残基，特别是F链上的His78、His118和His126位点。尽管通过PROCHECK和ERRAT验证的蛋白模型提供了可靠基础，但所识别的结合位点特异性为靶向治疗提供了清晰路径。总体而言，该计算机模拟方法将Apt9和Apt8指定为高优先级候选物。未来将通过表面等离子体共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）等实验技术进行验证，以推进宫颈癌精准诊断与治疗工具的开发。