波兰人群中Leber遗传性视神经萎缩(LHON, Leber hereditary optic neuropathy)遗传风险因子的分析

《Journal of Applied Genetics》：Analysis of genetic risk factors for Leber hereditary optic neuropathy in the Polish population

　　

摘要：Leber遗传性视神经萎缩（LHON, Leber hereditary optic neuropathy）主要由致病性线粒体DNA（mtDNA, mitochondrial DNA）变异引起，最常见为MT-ND4基因中的m.11778G>A变异。仅存在该变异不足以引发以视力丧失为特征的临床症状，提示LHON具有不完全外显率（incomplete penetrance）及人群间修饰因子（modifying factors）差异。鉴于此，研究人员旨在调查先前提出的两个LHON遗传风险因子在波兰人群中的作用。研究人员采用实时荧光定量PCR（qPCR, quantitative PCR）检测m.11778G>A变异的有症状与无症状携带者外周血中mtDNA拷贝数（mtCN, mtDNA copy number），并采用PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）评估有症状者、无症状者及对照组个体中PRICKLE3基因c.157C>T变异的频率。研究结果表明，在所测试条件下，波兰队列中mtDNA拷贝数与LHON症状表达无关联，不同于其他人群此前的报道；此外，PRICKLE3 c.157C>T变异在本队列中完全缺失，表明其并非波兰人群LHON外显率的常见修饰因子。上述发现提示波兰人群LHON的不完全外显可能涉及其他修饰因子，如尚未鉴定的核DNA（nuclear DNA）变异。

论文解读：波兰人群中Leber遗传性视神经萎缩(LHON)遗传风险因子的分析

该研究发表于《Journal of Applied Genetics》。Leber遗传性视神经萎缩（LHON, Leber hereditary optic neuropathy）是一种母系遗传的线粒体疾病，典型表现为视网膜神经节细胞变性及视神经萎缩导致急性或亚急性双眼视力丧失。全球约90%以上的LHON病例由三个原发致病性mtDNA点突变之一引起，其中最常见为MT-ND4基因m.11778G>A（简称m.11778G>A）。然而仅携带原发致病变异并不发病，男性外显率约50%，女性仅10%–20%，且存在显著的人群与种族差异，提示LHON为多因子疾病——除原发mtDNA突变外，还需环境诱因（吸烟、饮酒）及遗传修饰因子（mtDNA单倍群haplogroup、核基因组修饰基因、mtDNA拷贝数mtCN等）共同作用。既往西方人群研究发现未发病携带者外周血白细胞mtDNA拷贝数（mtCN, mtDNA copy number）较发病者高30%–40%，即低mtCN可能是LHON风险因子；另在中国人群报道PRICKLE3基因核黄素c.157C>T（p.Arg53Trp）可与m.11778G>A协同增加外显率与提前发病。但上述两个候选修饰因子是否在波兰（中欧）LHON人群中成立尚无研究。为此，研究人员以波兰m.11778G>A携带者及健康对照为对象，验证mtCN及PRICKLE3 c.157C>T是否为LHON外显率修饰因子。

主要关键技术方法

研究人员纳入波兰裔受试者共262例，分为三组：(1)有症状m.11778G>A携带者（男65，女4，N=69，平均年龄29.3±10.4岁）；(2)无症状m.11778G>A携带者（男6，女25，N=31，平均年龄39.7±16.1岁，多为先证者亲属）；(3)mtCN分析用健康男性对照（N=68，平均年龄21.8±1.1岁），PRICKLE3筛查用健康白内障手术对照（N=94，排除LHON及其他眼底病及mtDNA致病变异）。mtDNA拷贝数通过qPCR同步扩增线粒体MT-ND1基因与核内B2M（β-2 microglobulin）基因，以MT-ND1/B2M比值计算mtCN并经标准曲线校准。PRICKLE3 c.157C>T检测采用PCR-RFLP法，引物扩增后经SacII酶切鉴定（野生型被切开为475 bp+249 bp，c.157C>T变异使酶切位点消失保留724 bp未切片段）。统计采用Shapiro-Wilk检验正态性，Kruskal-Wallis检验及Mann-Whitney U检验比较组间mtCN，Brown-Forsythe检验比较方差，Spearman秩相关分析年龄与mtCN关系，显著性阈值p<0.05。

研究结果

Results — mtDNA拷贝数分析结果

波兰m.11778G>A有症状携带者外周血mtCN均值±SD为88±39.51（中位数77，范围24–207），无症状携带者为75±20.17（中位数73，范围33–138），健康对照为82±17.01（中位数80，范围52–123）。Kruskal-Wallis检验显示三组间mtCN分布无统计学显著差异（H=3.28, p=0.194）；男女间mtCN亦无显著差异（U=1529.5, p=0.13）。Brown-Forsythe检验示三组mtCN方差不齐（F=14.91, p=1.1×10^?6），有症状组方差（s²=1584.28）显著高于无症状组（s²=420.46, p=5.6×10^?6）及对照组（s²=293.77, p=1.3×10^?3），而后两组方差无差异。Spearman相关分析显示各亚组及全队列中年龄与mtCN均无显著相关（有症状组ρ=0.114, p=0.371；无症状组ρ=0.084, p=0.690；对照组ρ=0.031, p=0.802；全队列ρ=0.004, p=0.957）。结论：在所测条件下，外周血mtCN均值不受LHON是否发病影响，不支持mtCN降低是波兰人群m.11778G>A相关LHON的外显率修饰因子，但有症状个体mtCN离散度更大。

Results — PRICKLE3 c.157C>T变异筛查结果

对69例LHON患者、31例无症状m.11778G>A携带者及94例健康对照（共261条X染色体，女性双等位、男性单等位）进行PCR-RFLP筛查，未检出任一c.157C>T变异等位基因（0/261）。按95%置信度推算该变异在波兰研究人群中等位基因频率<1.15%，与gnomAD欧洲人群极低频率（2.2×10^?6）相符。结论：PRICKLE3 c.157C>T变异在波兰LHON队列中不存在，非波兰人群LHON外显率常见核修饰因子。

讨论与结论

研究人员指出，虽外周血mtCN均值在发病与未发病m.11778G>A携带者间无差异（不同于西欧、南欧报道），但有症状组mtCN方差显著增大，可能反映发病个体对复合体Ⅰ缺陷的线粒体生物合成代偿反应个体差异大，部分掩盖了潜在关联。无症状组平均年龄偏大但未发现年龄与mtCN相关，提示年龄偏倚对本研究mtCN结果影响有限。PRICKLE3 c.157C>T在中国人群报道具修饰作用但在欧洲（含波兰）近乎缺如，印证人群间候选修饰因子频率差异及开展群体特异性研究的必要性。波兰人群m.11778G>A LHON外显率的遗传修饰可能涉及其他核基因（如近期在中东欧检出的DNAJC30 c.152A>G/p.Tyr51Cys常染色体隐性LHON致病/修饰变异）或mtDNA单倍群背景（波兰此前报道单倍群K可能为修饰因子，单倍群J无关联）。本研究局限含样本量中等、无症状组偏小、性别分布不均（症状组男多女少、无症状组女多男少限制性别分层分析）、未系统收集吸烟等环境变量、部分历史样本异质性水平仅定性确认（但均接近或达同质型homoplasmy >99%）。综上，研究人员得出结论：在波兰m.11778G>A携带者中，(1)外周血mtDNA拷贝数（mtCN）与LHON症状发生无显著关联，不支持其为该人群常见外显率修饰因子；(2)PRICKLE3基因c.157C>T（p.Arg53Trp）变异在波兰人群中缺如，非波兰LHON外显率常见核修饰因子；LHON不完全外显的遗传基础具人群异质性，波兰人群可能涉及其他尚未鉴定的核DNA变异（如DNAJC30等）及mtDNA单倍群交互作用，需大样本多因素联合研究进一步阐明。