α-突触核蛋白(α-synuclein, α-Syn)聚集抑制剂通过线粒体韧性发挥帕金森病神经保护作用

《Journal of Advanced Research》：A α-synuclein aggregation inhibitor exerts neuroprotective effects via mitochondrial resilience in Parkinson’s disease

　　

摘要：帕金森病(Parkinson's disease, PD)的发病由α-突触核蛋白(alpha-synuclein, α-Syn)聚集与线粒体崩溃的恶性循环所驱动。打破该致病环路需要有疾病修饰作用的治疗药物，既能破坏毒性α-Syn的结构核心又能挽救生物能学衰竭，这凸显了新型双重作用神经保护剂的迫切需求。目的：鉴定并表征新型小分子调节剂A14，评估其抑制α-Syn纤维化及减轻PD下游线粒体缺陷的双重能力。方法：基于结构的虚拟筛选将A14鉴定为α-Syn纤维β-片层界面的靶向抑制剂；通过多维结构实验阐明其生物物理机制；在细胞模型及A53T α-Syn转基因小鼠中系统评价疗效，采用转录组学和透射电镜检测线粒体完整性，功能性磁共振成像(fMRI)及电生理评估黑质回路功能。结果：A14以高亲和力(Kd = 27.9 ± 2.16 nM)结合α-Syn纤维β-片层核心，将β-片层含量从21.4%显著降至9.3%，使聚集轨迹转向小粒径(<20 nm)、蛋白酶敏感的中间体。神经元模型中A14不依赖主要蛋白稳态途径直接通过生物物理调节减少胞内α-Syn包涵体。体内实验中A14阻断α-Syn与线粒体的病理性相互作用，挽救线粒体嵴超微结构、氧化磷酸化及整体生物能学。这种蛋白稳态与线粒体功能的协同恢复防止多巴胺能神经元丢失，使皮质-基底节-黑质功能连接正常化，并显著改善A53T转基因小鼠运动缺陷。结论：研究发现A14通过抑制α-Syn聚集和挽救线粒体缺陷的互补机制发挥作用，双重作用稳定蛋白稳态并维持线粒体功能，是PD治疗的候选化合物。

论文解读：α-Synuclein聚集抑制剂通过线粒体韧性发挥帕金森病神经保护作用——基于化合物A14的双重机制研究

本文由中国医学科学院药物研究所陈乃宏(Naihong Chen)、储石枫(Shifeng Chu)、张钊(Zhao Zhang)团队完成，发表于《Journal of Advanced Research》。

研究背景与立题依据

帕金森病(Parkinson's disease, PD)以中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元选择性退变及路易小体(Lewy body, LB)中α-突触核蛋白(alpha-synuclein, α-Syn)沉积为核心病理特征。α-Syn由可溶无序态向富含β-片层(β-sheet)的淀粉样纤维转化是主要驱动因素，并与线粒体功能障碍形成双向恶性循环：异常α-Syn寡聚体/纤维结合线粒体外膜，损害蛋白导入、破坏电子传递链(electron transport chain, ETC)尤其是复合物Ⅰ(Complex Ⅰ)，诱导线粒体碎片化；而线粒体活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高及ATP耗竭又加速α-Syn错误折叠。现有对症治疗（左旋多巴）无法阻断病程，已进入临床的α-Syn靶向小分子多作用于柔性C端或依赖胞外清除，针对纤维刚性β-片层核心——即非淀粉样β组分(non-amyloid-β component, NAC)区Greek-key基序——的小分子稀缺，且兼具直接线粒体保护的双重作用药物更为罕见。本研究假设高亲和力结构性调节α-Syn纤维核心不仅能重定向蛋白构象，还可解除细胞器功能负担，故通过结构导向虚拟筛选鉴定化合物A14并系统评价其双重机制。

主要关键技术方法

研究人员以PDB 2N0A中α-Syn纤维残基34–99简化模型为靶标，对ChemDiv库进行基于结构的虚拟筛选(SBVS)和Discovery Studio分子对接，经分子动力学(molecular dynamics, MD)模拟及MM/GBSA结合自由能计算锁定A14；微量热泳(microscale thermophoresis, MST)测定结合亲和力Kd，核磁共振[nitrogen-15–proton, ¹⁵N–¹H]异核单量子相干(heteronuclear single quantum coherence, HSQC)谱解析残基水平互作，硫黄素T(Thioflavin-T, Th-T)荧光、圆二色(circular dichroism, CD)光谱、透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)及纳米颗粒示踪分析聚集动力学与二级结构；采用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)及Thioflavin-S(ThS)染色在SNCA(A53T)-SY5Y和H4细胞中检测胞内α-Syn聚集；分离原代A53T及野生型(wild type, WT)小鼠中脑多巴胺能神经元，通过免疫电镜、转录组测序(RNA-seq)、Seahorse XF线粒体压力测试、JC-1膜电位检测、ROS探针评价线粒体完整性；使用12月龄A53T α-Syn转基因小鼠[B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*-A53T)83Vle/JNju]及C57BL/6小鼠MPTP/probenecid模型，灌胃给予A14(20 mg/kg)40天，进行转棒(rotarod)、平衡木(beam walking)、爬杆(pole test)、抓力及旷场(open field)行为学测试；活体电生理记录SNc多巴胺能神经元放电，静息态功能性磁共振成像(resting-state fMRI)分析皮质-基底节-黑质功能连接，振幅低频涨落(amplitude of low-frequency fluctuation, ALFF)及区域一致性(regional homogeneity, ReHo)评估局部神经元活动；免疫荧光/免疫印迹检测酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)⁺神经元数、α-Syn聚集及pS¹²⁹-α-Syn、硝基化α-Syn水平；单次灌胃20 mg/kg测定A14药代动力学(血浆及脑组织浓度–时间曲线，非房室模型分析)及200 mg/kg 14天初步安全性评价。

研究结果

A14 demonstrates inhibitory effects on the aggregation of α-Syn in vitro（A14在体外抑制α-Syn聚集）

分子对接显示A14锚定于α-Syn纤维Greek-key基序β-片层界面，与Gln359、Val360、Thr229、Thr295、Thr361形成氢键并与Val433、Glu424、Val301发生疏水作用，MD模拟RMSD稳定在1.5 ?，结合自由能?41.94±2.61 kcal/mol。MST测得A14与α-Syn纤维Kd=27.9±2.16 nM；[¹⁵N–¹H]HSQC显示V3、E83、T92等关键残基化学位移明显扰动，证实直接结合。Th-T荧光显示A14剂量依赖性抑制A53T α-Syn聚集（半数抑制浓度附近），将β-片层含量从21.4%降至9.3%、α-螺旋从2.9%升至7.5%；TEM及纳米颗粒追踪显示聚集物粒径从>500 nm降至<40 nm（多数<20 nm），蛋白酶K更易降解；在Aβ或mHTT聚集体系中无抑制效应，具α-Syn选择性。细胞实验中A14降低SNCA(A53T)过表达SH-SY5Y细胞中α-Syn寡聚体水平，且该作用不被自噬抑制剂3-MA或蛋白酶体抑制剂MG132取消，也不改变溶酶体酸化、蛋白酶体活性及Hsp70/Hsp90表达，表明A14通过直接生物物理破坏纤维β-片层结构使聚集转向易被基础蛋白酶降解的小分子中间体，而非上调细胞清除途径。

A14 inhibits the formation of intracellular α-Syn aggregates（A14抑制胞内α-Syn聚集物形成）

HEK293T细胞BiFC系统显示A14处理显著降低VN-α-Syn/α-Syn-VC重构荧光强度，抑制α-Syn聚合。在SNCA(A53T)-mCherry转导SH-SY5Y神经元中，A14使无包涵体细胞比例从6.47%升至61.27%，含>5个包涵体细胞从76.79%降至2.66%；SNCA(A53T)-EGFP转导H4细胞成像流式显示无聚集细胞比例从0.51%升至72.5%，含>5个包涵体从63%降至13.11%。证实A14在神经元细胞内有效抑制α-Syn异常聚集。

A14 resists α-Syn induced mitochondrial perturbations（A14抵抗α-Syn诱导的线粒体扰动）

免疫电镜显示A53T转基因小鼠神经元线粒体膜伴α-Syn免疫金标记及基质内陷，A14处理后α-Syn信号消散、线粒体超微结构与WT相当。转录组分析：A53T vs WT下调电子传递链及ATP合成相关基因，A14处理使其上调并回复至接近WT水平，GO富集显示线粒体电子传递、中脑多巴胺能分化及突触传递相关通路被挽救，说明A14解除α-Syn对线粒体的病理性结合并逆转转录水平线粒体功能抑制。

A14 protected mitochondrial dysfunction to against PD（A14保护线粒体功能障碍拮抗PD）

Seahorse XF分析显示A14恢复基础呼吸、最大呼吸容量、质子漏调节及ATP偶联耗氧率(oxygen consumption rate, OCR)；细胞内ATP水平回升，总ROS及线粒体超氧化物(MitoSOX)降低，JC-1红/绿荧光比升高提示线粒体膜电位恢复。MitoTracker染色显示A14改善A53T过表达导致的线粒体形态因子(form factor)下降（从62.18%恢复至82.46%）、纵横比及截面面积恢复。在α-Syn非依赖的MPP⁺（1-甲基-4-苯基吡啶离子）损伤模型中A14同样改善OCR、ATP、ROS及形态特征，表明A14兼具解除α-Syn物理束缚的直接线粒体保护/生物能恢复作用。

A14 attenuates motor dysfunction in A53T α-Syn transgenic mice models（A14减轻A53T α-Syn转基因小鼠运动功能障碍）

A53T转基因小鼠经A14(20 mg/kg, ig)连续40天给药，平衡木通过时间缩短、爬杆下行潜伏期减少、转棒停留时间延长、前肢抓力增强，旷场总移动距离及穿格数增加，接近WT水平；步态分析示步长恢复(7.075±0.947 cm vs A53T 5.437 cm)、支撑基底部缩窄。停药4周后上述运动改善仍维持，提示疾病修饰而非单纯症状缓解。

A14 enhances brain functional connectivity in A53T α-Syn transgenic mice（A14增强A53T α-Syn转基因小鼠脑功能连接）

静息态fMRI显示A53T组皮质-基底节-黑质网络功能连接减弱，A14恢复至WT等价水平。ALFF及ReHo值在尾壳核(caudate putamen, CPu/Str)、丘脑(thalamus, TH)、SNc、中脑及后脑升高；SNc区ALFF/ReHo值与爬杆、平衡木、转棒成绩显著正相关(p<0.05)。SNc为种子点的功能连接雷达图显示A14使左右SNc与各脑区连接恢复。在体电生理示A14提高SNc多巴胺能神经元放电频率、延长爆发式放电时长及占比，局部场电位(local field potential, LFP)中β频段(12–30 Hz)功率降低、γ频段(30–80 Hz)振荡增强，符合PD经典电生理标志改善。

A14 prevents the degeneration of the substantia nigra-striatum system（A14阻止黑质-纹状体系统变性）

A14处理减少A53T小鼠SNc区TH⁺多巴胺能神经元丢失（免疫组化点计数）及纹状体TH⁺纤维密度下降（平均光密度），Western blot示TH蛋白量维持；Fluoro-Jade B退变神经元标记信号减弱；ThS⁺α-Syn包涵体在SNc减少，无包涵体细胞比例上升、含>10个包涵体细胞比例下降；可溶/不溶组分分离示不溶α-Syn减少，pS¹²⁹-α-Syn及硝基化α-Syn(nitrotyrosine-α-Syn)水平降至WT基线，单体α-Syn(15 kDa)不受影响。透射电镜示A14组SNc线粒体嵴结构完整、无肿胀退化，确认体内线粒体超微结构挽救。

Pharmacokinetic characteristics and preliminary safety of A14（A14的药代动力学特征与初步安全性）

单次灌胃20 mg/kg后A14血浆T_max=2 h，C_max=560.67±22.03 ng/mL，t_1/2=3.97±0.18 h，AUC_last=2948.33 h·ng/mL；脑组织T_max=2 h，C_max=935.67±29.07 ng/g，t_1/2=5.22±0.25 h，AUC_last,Brain/AUC_last,Plasma=1.20，提示A14可快速入脑且脑暴露略高于血浆。连续14天灌胃200 mg/kg未见体重、生存率、血清生化(ALT/AST/BUN/CRE等)异常，心肝脾肺肾组织病理无损伤，初步安全性良好。

讨论与结论翻译

讨论指出A14不同于靶向C端或免疫清除策略，特异性插入α-Syn纤维NAC区β-片层核心Greek-key基序，通过氢键与疏水作用破坏分子间β-片层堆叠，将聚集重定向为非毒性质蛋白酶敏感小寡聚体；不依赖激活自噬/蛋白酶体而是通过直接生物物理去稳定化增加聚集物对基础蛋白酶敏感性；同时解除α-Syn与线粒体外膜病理性结合并在MPP⁺模型中具直接线粒体保护，打断蛋白错误折叠–氧化应激恶性循环；fMRI及电生理证实A14恢复皮质-基底节-黑质回路功能连接与多巴胺能神经元放电模式。局限包括A53T为家族性PD模型未涵盖散发性环境因素，A14对细胞间α-Syn传播(prion-like spreading)的影响及线粒体直接靶点有待后续研究。

结论：A14作为α-Syn靶向调节剂，通过双重互补机制发挥PD疾病修饰效应——(1)高亲和力结合α-Syn纤维β-片层核心，破坏毒性聚集、降低β-片层含量并将α-Syn聚集重定向为非毒性质蛋白酶敏感寡聚体，不影响生理单体；(2)协同挽救线粒体嵴超微结构、氧化磷酸化及抑制ROS，拮抗α-Syn诱导的生物能崩溃。在细胞模型及A53T α-Syn转基因小鼠中A14减少α-Syn包涵体负荷、保存SNc多巴胺能神经元、改善运动缺陷并恢复黑质纹状体回路功能连接。通过整合蛋白稳态调控与线粒体韧性，A14打破蛋白病与生物能衰竭的恶性循环，是具前景的PD治疗候选分子，为下一代兼顾α-Syn聚集抑制与线粒体功能修复的神经退行性疾病治疗策略提供机制框架。