《Journal of Anatomy》：The ciliary neurotrophic factor induces Stat3 phosphorylation in distinctive cytotypes of organs involved in body metabolism: An immunohistochemical study
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腹腔注射外源性睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF，0.3 mg/kg）可在人类及实验动物中减少摄食量和体重，并改善高血糖、高胰岛素血症及血脂异常。CNTF发挥抗肥胖及抗糖尿病效应时，除作用于脑内摄食中枢外，还可靶
腹腔注射外源性睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF，0.3 mg/kg）可在人类及实验动物中减少摄食量和体重，并改善高血糖、高胰岛素血症及血脂异常。CNTF发挥抗肥胖及抗糖尿病效应时，除作用于脑内摄食中枢外，还可靶向多个外周代谢相关器官并诱导转录因子信号转ducers和激活子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）的磷酸化（p-STAT3）。但目前尚缺乏外源性CNTF在体内特异性靶向哪些代谢相关外周器官特定细胞类型的直接证据。本研究首先通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测成年雄性小鼠胃肠（gastrointestinal，GI）道、胰腺、肝脏、内脏及皮下白色脂肪组织（white adipose tissue，WAT）、肩胛间棕色脂肪组织（interscapular brown adipose tissue，iBAT）、骨骼肌及坐骨神经中三元CNTF受体复合体各亚基——Cntfrα、白血病抑制因子受体β（leukemia inhibitory factor receptor β，Lifrβ）及糖蛋白130（glycoprotein 130，gp130）——的mRNA表达水平；随后通过Western blotting检测腹腔注射CNTF或生理盐水后上述器官的p-STAT3水平；最后通过免疫组织化学结合形态计量学及共聚焦显微镜，在CNTF处理组与对照组小鼠中定位CNTF响应细胞。结果显示，Lifrβ和gp130在所有受检器官中广泛表达；Cntfrα在骨骼肌、坐骨神经及iBAT中表达最高，在其他部位表达较低。CNTF给药后，除十二指肠外所有检测器官的p-STAT3/总STAT3蛋白比值均显著升高，并在细胞核产生特征性p-STAT3免疫阳性反应。沿GI道，CNTF诱导肠神经系统黏膜下丛和肌间丛神经元及肌层外部平滑肌细胞发生核STAT3磷酸化，回肠系膜段和结肠反应最强。胰腺中CNTF在内分泌部（尤其是胰岛）比外分泌部引发更强的STAT3活化。肝脏中CNTF不仅诱导肝实质细胞，还诱导肝窦内皮细胞及驻留巨噬细胞（Kupffer细胞）发生STAT3磷酸化。该细胞因子可激活皮下及内脏白色脂肪细胞的p-STAT3，也可激活棕色脂肪细胞，其中皮下脂肪中的米色（beige）脂肪细胞反应最显著；脂肪组织驻留巨噬细胞及多处血管的内皮细胞也对CNTF有响应。骨骼肌作为葡萄糖/脂质利用的主要场所，CNTF诱导肌纤维广泛核p-STAT3免疫阳性，并激活支配腓肠肌的周围神经（包括坐骨神经）中结缔组织及施万细胞（Schwann cells）。综上所述，数据表明CNTF在代谢相关器官和组织多种细胞类型中发挥作用，其外周代谢效应可能通过这种细胞异质性得以实现。
论文解读：睫状神经营养因子（CNTF）诱导代谢相关器官特异性细胞类型内的Stat3磷酸化——一项基于免疫组织化学的在体定位研究
该论文发表于《Journal of Anatomy》。
一、研究背景与立项依据
睫状神经营养因子（Ciliary Neurotrophic Factor，CNTF）属白细胞介素（Interleukin，IL）-6细胞因子家族，既往已知外源性CNTF可减少摄食、降低体重并改善肥胖相关代谢紊乱（高血糖、高胰岛素血症、脂代谢异常），其经典信号通路为激活Janus激酶（Janus family of tyrosine kinases，JAK）——信号转导与转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3），即JAK-STAT3通路，引起STAT3酪氨酸磷酸化（phosphorylated STAT3，p-STAT3）并转位入核。CNTF除作用于下丘脑及延髓摄食中枢外，也被认为可直接作用于肝脏、胰腺、骨骼肌及脂肪组织等外周代谢器官发挥代谢调控作用，然而至今缺乏外源性CNTF在体（in vivo）条件下具体靶向哪些外周代谢器官中何种细胞类型的系统性解剖学证据。CNTF需结合由配体特异性α亚基（Cntfrα）、信号转导亚基gp130（glycoprotein 130，gp130）及白血病抑制因子受体β（Leukemia Inhibitory Factor Receptor β，Lifrβ）组成的三元受体复合体启动信号，其中Cntfrα决定CNTF信号特异性。因此，明确各外周代谢器官中CNTF受体分布及其功能性p-STAT3响应的细胞类型，是理解CNTF外周代谢作用机制的结构基础。本研究旨在以腹腔注射CNTF后45 min核p-STAT3免疫阳性为功能标志，绘制代谢相关外周器官中CNTF响应细胞的在体分布图谱。
二、主要实验方法概述
研究人员采用2月龄雄性C57BL/6小鼠，设置CNTF（0.3 mg/kg，腹腔注射）处理组与生理盐水对照组，于注射后45 min取材。所取代谢相关外周器官包括胃、十二指肠、肠系膜小肠（空肠及回肠）、结肠、肝脏、胰腺、腹股沟白色脂肪组织（inguinal WAT，iWAT）、附睾白色脂肪组织（epididymal WAT，eWAT）、肩胛间棕色脂肪组织（interscapular BAT，iBAT）、腓肠肌骨骼肌及坐骨神经。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR，内参基因为TATA框结合蛋白Tbp）检测Cntfrα、Lifrβ及gp130的mRNA表达；通过Western blotting检测p-STAT3与总STAT3蛋白比值评估通路活化；通过过氧化物酶免疫组织化学及双标免疫荧光共聚焦显微镜鉴定p-STAT3阳性细胞核并共定位细胞类型特异性标记物（如PGP9.5标记肠神经元、胰岛素/胰高血糖素标记胰岛α/β细胞、F4/80标记巨噬细胞、PLIN-1标记白色脂肪细胞、UCP1标记棕色脂肪细胞、S100b标记施万细胞、PECAM-1标记血管内皮细胞）；通过盲法形态计量学统计各部位p-STAT3阳性核占比。
三、研究结果
3.1 代谢相关外周器官中Cntfrα、Lifrβ及gp130转录本的表达
qRT-PCR结果显示gp130与Lifrβ在所有受检外周器官中广泛且高水平表达。Cntfrα则在骨骼肌、坐骨神经及iBAT中表达最高，其次为肝脏和胃，十二指肠、肠系膜肠段及结肠表达相对较低；胰腺因高核糖核酸酶活性影响RNA质量，辅以Tabula Muris单细胞RNA测序数据集交叉验证确认Cntfrα在胰岛内分泌细胞中选择性表达。表明虽然Cntfrα分布具组织特异性，但gp130/Lifrβ的普遍存在使这些器官均可成为IL-6家族细胞因子潜在靶点。
3.2 CNTF响应细胞在代谢相关外周器官中的检测与表征
3.2.1 胃肠道（Gastrointestinal Tract，GI Tract）
Western blot显示胃及肠系膜肠段p-STAT3/STAT3比值显著升高，十二指肠总蛋白水平未见显著升高但免疫组化仍可见局灶响应。免疫组化及双标共聚焦证实CNTF不激活肠黏膜上皮细胞及肠内分泌（GLP-1?/GIP?）细胞，而是诱导黏膜固有层结缔组织/免疫细胞/内皮细胞、黏膜下结缔组织及血管内皮细胞、肌层外部平滑肌细胞发生核p-STAT3阳性，并于肠系膜小肠和结肠中最强；在黏膜下丛与肌间丛可见p-STAT3与泛神经元标记PGP9.5共标，证实肠神经系统（Enteric Nervous System，ENS）神经元亦为CNTF靶细胞。结论：CNTF在外周GI道主要靶向固有层、黏膜下、肌层及ENS神经元，而非吸收/分泌上皮，可能通过调节肠动力或腺体功能间接影响GI功能。
3.2.2 胰腺
Western blot示胰腺总p-STAT3显著升高。对照组中腺泡细胞有一定本底STAT3磷酸化，胰岛几乎无本底；CNTF处理后内分泌胰岛α细胞（胰高血糖素?）与β细胞（胰岛素?）均出现强烈核p-STAT3（约43％胰岛细胞核阳性），外分泌腺泡细胞虽有升高但幅度较小。结论：胰腺内分泌部尤其胰岛是CNTF最主要的外周靶部位之一，且同时激活α及β细胞。
3.2.3 肝脏
Western blot示肝脏p-STAT3显著诱导。免疫组化见大量肝细胞（包括双核及多倍体肝细胞）核p-STAT3阳性；肝窦内皮细胞及窦内驻留巨噬细胞（Kupffer细胞，F4/80?）也呈p-STAT3核阳性。结论：CNTF在肝脏同时激活肝实质细胞与肝窦免疫-血管组分，支持其参与调控肝脏糖脂代谢及可能炎症调节。
3.2.4 脂肪组织
eWAT（内脏WAT）：Western blot示p-STAT3升高；免疫组化见白色脂肪细胞（PLIN-1?）、驻留巨噬细胞（F4/80?）及小血管PECAM-1?内皮细胞呈核p-STAT3阳性。iWAT（皮下WAT含beige细胞）：白色脂肪细胞与形态学上具少量脂滴的米色（beige）脂肪细胞均p-STAT3阳性，其中beige细胞响应率最高（约59％），小血管內皮细胞亦阳性但巨噬细胞未见明显响应。iBAT：棕色脂肪细胞（UCP1?）及小血管內皮细胞p-STAT3阳性。结论：CNTF激活各脂肪库脂肪细胞（白、棕、米色）及部分血管成分，且在皮下WAT中对产热表型的beige脂肪细胞激活尤为突出，内脏WAT还额外激活脂肪组织巨噬细胞。
3.2.5 骨骼肌
腓肠肌Western blot示p-STAT3显著升高；免疫组化见横纹肌纤维周边核广泛p-STAT3阳性（约36％），伴供血小血管內皮细胞阳性；支配骨骼肌的肌内周围神经及坐骨神经中，施万细胞（S100b?）及神经外膜结缔组织细胞呈强p-STAT3核阳性（坐骨神经约45％细胞核阳性）。结论：CNTF在骨骼肌不仅靶向能量底物利用的主细胞——肌纤维，也靶向其神经支配的施万细胞，提示外周神经系统亦为CNTF作用对象。
四、讨论与结论总结（翻译并浓缩原文Discussion及Conclusion）
讨论指出，本研究首次提供外源性CNTF在体激活外周代谢器官p-STAT3的细胞类型分布图谱。GI道低Cntfrα却出现强p-STAT3提示可能存在低受体密度高效信号或CNTF可溶性受体α介导的"转信号（trans-signaling）"机制（依赖gp130/Lifrβ）。ENS与肌层同步激活提示CNTF可能直接调节肠动力，为临床试验中CNTF引起的恶心/呕吐副作用提供外周机制解释。胰腺中α与β细胞均被激活支持CNTF协调影响葡萄糖稳态。肝脏中肝细胞与Kupffer细胞共激活与其改善糖脂代谢及潜在抗炎作用相符。脂肪组织中beige细胞高响应及巨噬细胞（仅内脏WAT）激活与CNTF促进脂肪分解、棕色化/米色化及改善脂肪组织炎症状态一致。骨骼肌及施万细胞激活与CNTF增强肌糖脂利用及潜在自分泌/旁分泌回路相符。研究局限性包括仅观察急性响应未做功能缺失实验、仅用雄性小鼠未评估性别差异、不能排除极微量内源性IL-6次级效应对45 min时相STAT3的影响。
研究结论： 腹腔给予CNTF可在除十二指肠外的所有检测代谢相关外周器官中诱导STAT3磷酸化，并显现明确的细胞类型特异性——GI道（ENS神经元、平滑肌、固有层/黏膜下结缔组织及血管內皮）、胰腺（胰岛α/β细胞＞外分泌腺泡）、肝脏（肝细胞、肝窦内皮及Kupffer细胞）、白色/Brown/米色脂肪细胞（皮下beige最强）及脂肪组织驻留巨噬细胞（仅内脏WAT）与血管內皮、骨骼肌肌纤维及支配外周神经施万细胞。这些数据表明CNTF在外周代谢器官多细胞类型发挥作用，其外周代谢效应很可能通过此种细胞异质性得以实现。
