面向斑马鱼精神疾病的建模：神经突触黏附蛋白严重调节焦虑、亲和性社会行为及攻击行为

《Molecular Psychiatry》：Towards modelling mental disorders in zebrafish. Neurexins severely modulate anxiety, affiliative social behaviour and aggression

　　

神经突触黏附蛋白（Neurexin, nrxn）基因编码突触细胞黏附分子，已被反复证实与神经发育及精神障碍相关。尽管斑马鱼动物模型在解析神经发育与功能方面具有巨大优势，但目前尚无完整的神经突触黏附蛋白功能丧失（Loss-of-function, LOF）斑马鱼模型可供研究。在本研究中，研究人员首次为每个nrxn基因构建了斑马鱼敲除品系，突变类型涵盖跨膜结构域缺失至全基因组位点缺失。令人惊讶的是，所有纯合子品系均正常发育，未呈现显著的神经发育异常或明显的早期行为缺陷。然而，这种早期表型的缺失在后续发育阶段转化为深刻的、旁系同源基因特异性的行为改变。所有神经突触黏附蛋白敲除株系均影响交配行为，使得纯合子品系的建立与维持变得复杂。除这一共享的行为改变外，仅nrxn1而非nrxn2或nrxn3导致亲和性社会行为及攻击行为的显著变化。与此相反，nrxn2突变体表现出严重的焦虑样行为，包括底部停留及反复的僵直/抽搐样发作。引人注目的是，nrxn1全位点缺失突变体则呈现相反的行为表现，大部分时间在水体表层活动。两者对于开放/封闭环境转换也表现出相反的应答：封闭环境缓解了nrxn2的焦虑行为，但加剧了nrxn1的表层停留行为。与此同时，nrxn3突变体在所有初始测试中均表现正常。综上所述，本研究引入了一套覆盖完整nrxn基因家族的斑马鱼突变体，尽管缺乏可察觉的早期缺陷，却呈现了显著的成年期行为改变；这与精神分裂症等人类精神障碍的延迟发病特点相呼应。该研究证实了斑马鱼作为精神疾病研究模型的价值，并为揭示神经突触黏附蛋白的致病性贡献以及驱动精神疾病出现的相关细微神经发育改变/时序开辟了新的平台。

神经突触黏附蛋白（Neurexin, NRXN)作为编码突触形成、维持及信号转导所必需的跨膜细胞黏附分子，其基因家族成员NRXN1、NRXN2和NRXN3已被反复证实与多种精神及神经发育障碍相关，涵盖精神分裂症(Schizophrenia, SCZ)、孤独症(Autism Spectrum Disorder, ASD)、双相情感障碍(Bipolar Disorder, BD)乃至近年来的帕金森病(Parkinson's Disease, PD)。尽管过去二十年间已开发大量啮齿类动物模型并取得重要洞见，但其致病作用及与上述疾病的关联仍不清晰，亟需拓展研究工具以深化对该基因家族的理解。斑马鱼作为研究神经发育的理想模型，具有体外发育、光学透明等独特优势，便于早期脑发育的直接观察与操作，且光遗传学与钙成像技术的结合为解析该基因家族在正常及病理状态下的作用提供了独特途径。然而，目前尚缺乏完整的斑马鱼神经突触黏附蛋白功能丧失模型，现有研究仅通过传统小片段插入缺失针对有限基因组区域，无法消除全部神经突触黏附蛋白亚型。鉴于该基因家族通过多重启动子及复杂可变剪接产生数百种亚型，传统小片段插入缺失易产生截短蛋白并面临遗传补偿及隐秘剪接的风险，研究人员采用创新性CRISPR/Cas9策略构建了覆盖完整神经突触黏附蛋白基因家族的斑马鱼突变体集合，并系统比较了各纯合突变系从胚胎期至成年期的表型特征。

本研究采用的主要技术方法包括：CRISPR/Cas9基因编辑技术生成靶向大片段缺失突变体；RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析以验证分子效应；体式显微镜结合ImageJ进行胚胎及幼鱼形态测量；ZebraBox Revolution系统进行幼鱼游泳行为及应激反应分析；Olympus FV3000激光扫描共聚焦显微镜进行脑成像及体积定量；Zantiks LT自动行为学系统进行成年鱼多种行为测试，包括新奇水槽潜水测试(Novel Tank Diving Test, NTT)评估焦虑样行为、镜像咬击测试(Mirror Biting Test)评估攻击行为、社会偏好测试(Social Preference Test)评估亲和性社会行为、开放/封闭场地测试(Open/Closed Field Tests)评估群体行为模式、游泳隧道耐力测试(Swimming Tunnel Assay)评估运动能力，以及戊四氮(Pentylenetetrazole, PTZ)诱导实验评估网络兴奋性。样本来源于AB遗传背景的野生型及突变体品系，所有成年行为实验使用4-6月龄鱼，性别比例约1:1。

研究结果部分，"斑马鱼神经突触黏附蛋白突变体的生成"部分显示，研究人员采用实验室已建立的CRISPR/Cas9方法，针对nrxn1a、nrxn1b、nrxn2a、nrxn2b、nrxn3a、nrxn3b六个基因生成突变体，建立了分别命名为nrxn1a1b、nrxn2a2b、nrxn3a3b的双突变品系。突变类型包括全基因组缺失（"full"）、跨膜结构域缺失（"tmr"）以及nrxn1特有的部分缺失（"part"）。RNA-seq分析确认了突变的预期分子后果：完整基因组缺失导致相应转录本显著减少或缺失，而跨膜结构域突变不影响转录水平，与设计破坏蛋白定位但不改变基因表达的预期一致。除nrxn2a^tmr2b^tmr和nrxn3a^full3b^full双突变体中nrxn1b表达轻微增加外，未见旁系同源基因间的转录组补偿证据。

"神经突触黏附蛋白对斑马鱼胚胎及幼鱼早期发育无显著影响"部分表明，所有突变体在胚胎期和幼鱼期均未显示明显表型。突变体孵化及发育与野生型对照均无显著差异，体长在3至7日龄期间无统计学差异。2日龄时所有突变体对触摸刺激的反应与对照无差异。ZebraBox监测系统显示，所有双突变系在24分钟光暗交替、振动及光照应激组合协议中，游泳模式及反应强度与对照相当。从2至7日龄的脑发育实时监测显示，整体结构、大小及发育时序均无差异，支持神经突触黏附蛋白缺失情况下早期神经系统发育基本正常的结论。

"缺乏明显早期缺陷转化为深刻的成年期行为改变"部分揭示，虽然早期阶段未检测到明显行为或发育缺陷，但成年期出现了显著的行为改变。所有突变均影响交配行为。在养殖设施日常观察中，nrxn2a^full2b^full和nrxn2a^tmr2b^tmr突变体表现出近乎持续的底部停留行为，即使在喂食期间亦如此。

"nrxn2缺失诱发显著焦虑样行为"部分通过新奇水槽潜水测试证实，野生型对照平均23.16±8.8秒进入水体上部区域，而nrxn2a^full2b^full和nrxn2a^tmr2b^tmr突变体进入上部区域的潜伏期分别延长至314.4±8.8秒和580.1±66.8秒，37.5%的nrxn2a^tmr2b^tmr突变体从未探索至上部区域。垂直分布分析显示，野生型在下部区域花费28.6±2.3%的时间，而nrxn2a^full2b^full和nrxn2a^tmr2b^tmr分别达78±2.4%和92±2.4%。野生型在区域间转换421±45次，nrxn2a^full2b^full仅192±25次，nrxn2a^tmr2b^tmr仅43±15次。

"nrxn2缺失诱发强烈且反复的僵直/抽搐发作，但不影响游泳能力"部分显示，nrxn2a^full2b^full和nrxn2a^tmr2b^tmr表现出反复的僵直行为，常伴随突发性不协调游泳/活动爆发。nrxn2a^tmr2b^tmr僵直时间占实验时间的43±8%，显著高于野生型。模式分析揭示两种事件类型：僵直后恢复正常游泳，以及僵直后立即出现高速不协调活动爆发。定量分析显示nrxn2a^tmr2b^tmr平均每实验4±0.6次僵直事件，其中20.8±7.7%随后出现高速活动爆发。PTZ药理学挑战实验显示nrxn2a^tmr2b^tmr对1 mM PTZ表现出显著敏感性增高。游泳隧道耐力测试显示各突变体与野生型运动能力无差异，表明游泳距离减少源于行为改变而非运动缺陷。

"nrxn1缺失诱发异常的表层停留行为伴探索减少"部分指出，nrxn1a^full1b^full在新奇水槽潜水测试中未表现焦虑样行为，但显示出显著的顶部区域偏好，结合探索减少及总游泳距离降低。虽然nrxn1a^part1b^part和nrxn1a^tmr1b^tmr在此测试中未共享显著的顶部区域 preference，但在后续封闭场地测试中表现出类似的表层停留行为。

"nrxn1缺失调节社会偏好及攻击行为"部分显示，社会偏好测试中野生型花费77±4%时间接近同类，而nrxn1a^full1b^full、nrxn1a^part1b^part和nrxn1a^tmr1b^tmr分别仅花费30±3.4%、49±3.5%和43±3.8%。镜像咬击测试中野生型在镜面3 cm区域花费48±3.7%，而上述三系分别为29±3.7%、36±2%和40±1.9%。成对攻击测试进一步证实nrxn1a^full1b^full攻击交互显著降低至2±1次/分钟，对照为16±3次/分钟。nrxn2a^tmr2b^tmr在社会偏好及攻击测试中亦显示显著改变，但高频僵直及抽搐样发作可能混淆结果，需谨慎解读。

"nrxn1和nrxn2突变体对开放及封闭场地测试呈现相反反应"部分揭示，开放场地中nrxn2a^full2b^full和nrxn2a^tmr2b^tmr群体 bottom-dwelling 比例分别为80±4%和99±0.3%，野生型仅17±6%。封闭场地条件下nrxn2a^full2b^full恢复至与野生型无差异，nrxn2a^tmr2b^tmr bottom-dwelling 从99±0.3%降至68±5.5%。相反，nrxn1各突变系在开放场地中表现正常，封闭场地则触发显著表层停留行为：nrxn1a^full1b^full、nrxn1a^part1b^part和nrxn1a^tmr1b^tmr群体在表层分布比例分别为79±4.6%、88±3%和60±6%。

"nrxn3从早期至成年阶段未引发明显异常改变"部分表明，nrxn3a3b双突变体发育正常，在新奇水槽潜水、镜像咬击、社会交互及开放/封闭群体场地测试中均表现于对照范围内，提示NRXN3在所检测行为域中或为功能冗余。

讨论部分，研究人员强调本研究首次构建了完整的斑马鱼神经突触黏附蛋白敲除品系集合并进行了系统性比较表型分析，突出了神经突触黏附蛋白旁系同源基因在塑造成年行为中的独特且非冗余作用。早期明显发育缺陷的缺失与显著的成年期行为改变相结合，与精神分裂症、孤独症及双相情感障碍等许多神经发育及精神疾病的临床轨迹相似——这些疾病常缺乏明显神经解剖学标志，却表现为显著且快速进展的行为功能障碍。nrxn1和nrxn2功能丧失品系观察到的极端且稳健的表型， exemplify了斑马鱼用于研究精神健康及行为障碍遗传学的潜力。

数据显示nrxn1和nrxn2而非nrxn3对调节亲和性社会行为、焦虑及攻击行为至关重要。nrxn2缺失产生显著且高外显率的焦虑样表型，特征为显著/持续的底部停留、探索减少及频繁的僵直发作。这些僵直事件不仅限于经典应激诱导的不动性，模式分析显示僵直后伴随突发性不协调活动爆发，且nrxn2突变体对PTZ挑战表现出显著敏感性增高，提示网络兴奋性改变而非单纯的焦虑样行为增强。Koh等人的研究亦报道nrxn2a外显子2遗传破坏诱导焦虑及僵直样行为，但其表型随世代衰减，而研究人员的双突变体行为表型保持稳定，可能反映转录适应或其他补偿机制的差异。该解释与nrxn2在突触传递调节及兴奋/抑制平衡中的作用一致。哺乳动物中NRXN2在前脑应激反应环路富集，条件性删除破坏海马环路并增加抽搐易感性。神经突触黏附蛋白，特别是NRXN2，与孤独症谱系障碍及相关精神疾病密切相关，孤独症常伴显著神经精神共病，包括焦虑（~42-56%）、抑郁（12-70%）及癫痫（8-30%）高发率。nrxn2突变斑马鱼的持续焦虑样行为与间歇性抽搐样发作的组合，与人类神经精神疾病中常见改变的行为域相吻合。虽然尚需电生理学或钙成像直接确认抽搐活动，但行为学、药理学及跨物种证据的汇聚支持NRXN2在维持抑制性环路稳定性中的保守作用。

相反，nrxn1删除未诱发斑马鱼强烈的焦虑样行为，而是诱导亲和性社会行为、攻击行为及封闭场地条件下加剧的异常表层停留表型的深刻改变。这些结果与NRXN1与精神分裂症的强关联性相呼应，该疾病亦伴随显著的社会交互改变及攻击调节异常。小鼠神经突触黏附蛋白-1突变品系中亦发现类似的社会行为改变。nrxn1和nrxn2突变体之间的表型分歧尤为引人关注：封闭环境缓解nrxn2突变体的焦虑样行为，却 paradoxically 触发nrxn1突变体的异常表层停留。这提示不同神经突触黏附蛋白旁系同源基因调控环境线索如何整合入行为输出。人类中NRXN1缺失与精神分裂症及感觉运动门控异常强相关，而NRXN2与焦虑升高及ASD样特征相关。斑马鱼数据因此支持nrxn1和nrxn2通过不同神经通路差异处理环境和情境信息的观点，或可解释不同旁系同源基因与不同精神疾病的关联。

另一引人注目的观察是，斑马鱼神经突触黏附蛋白突变体在胚胎期或幼鱼期均未显示明显的发育或形态缺陷，脑体积、大体解剖及基本运动反应均与野生型对照无法区分，却在后续发育阶段出现深刻表型。这模仿了精神疾病的临床悖论——被广泛认可具有早期神经发育起源，却缺乏明显的发育异常。这种"沉默的发育轨迹"支持神经突触黏附蛋白功能障碍以潜在方式扰乱突触布线或可塑性，直至环路成熟或环境需求及社会交互需求增加时才显现的假设。斑马鱼的光学可及性及强大的在体成像工具，使其特别适合精确研究这种潜在环路破坏的时机和机制。

相比之下，nrxn3突变体在所进行的行为测试中未显示明显异常，但这不排除未捕获行为域的可能效应，且检测不到表型可能反映其他神经突触黏附蛋白旁系同源基因在共享神经环路中的功能部分冗余。斑马鱼神经突触黏附蛋白旁系同源基因在发育及成年期的详细时空表达图谱尚未系统表征，限制了直接验证这些假设的能力。

研究结论部分指出，本研究引入了首套覆盖完整神经突触黏附蛋白基因家族的斑马鱼突变体。尽管在胚胎期和幼鱼期未显示明显的神经发育或运动缺陷，这些品系揭示了仅在生命后期出现的、显著的旁系同源基因特异性行为紊乱。斑马鱼中nrxn1缺失主要改变亲和性社会行为及攻击行为，nrxn2则触发严重的焦虑样行为及抽搐样发作，而nrxn3缺失在所检测的所有行为域中似乎为可耐受，这与人类中NRXN3与精神健康障碍关联较弱相一致。斑马鱼中的这些表型轨迹模仿了人类精神健康研究中的核心挑战：大多数精神及神经发育障碍被广泛认为起源于生命早期，却常在早期发育中不呈现明显可检测的异常。通过在缺乏明显早期缺陷的情况下揭示显著的成年表型，这些突变体为探索早期发育与行为表现之间的细微、渐进性环路水平机制创造了独特机会。斑马鱼的光学可及性、遗传可操作性及全脑成像能力，使其成为解析突触黏附基因早期分子扰动如何转化为迟发性行为病理的异常强大的模型。因此，这些神经突触黏附蛋白突变体开辟了研究精神障碍发育时序、网络重组及机械起源的新途径，对理解疾病发生及识别新型治疗窗口具有直接相关性。