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摘要：基于生物素化（Biotinylation）的邻近标记（Proximity Labelling, PL）方法是发现细胞系统内蛋白-蛋白相互作用的重要工具。然而，现有方法的局限在于多数需将靶蛋白与具邻近生物素化活性的酶（如TurboID或APEX2）直接融合
摘要：基于生物素化（Biotinylation）的邻近标记（Proximity Labelling, PL）方法是发现细胞系统内蛋白-蛋白相互作用的重要工具。然而，现有方法的局限在于多数需将靶蛋白与具邻近生物素化活性的酶（如TurboID或APEX2）直接融合表达，存在空间位阻（Steric Hindrance）风险，可能干扰靶蛋白天然功能。本研究提出一种旨在降低融合表达位阻影响、并提供更大标记灵活性的新方法——ASAP-ID（Antibody and Small-tag Assembly on Proteins for Interaction Detection，抗原-小标签组装蛋白互作检测法）。该方法为双组分系统：靶蛋白融合小肽抗原（Epitope Tag），招募偶联抗该抗原抗体（纳米抗体scFv或羊驼纳米抗体Nanobody）的生物素连接酶TurboID或过氧化酶APEX2。研究人员利用两种抗原/抗体体系（SunTag与MoonTag）证明ASAP-ID可特异性标记细胞内人Lamin A。该方法在靶蛋白与纳米抗体融合蛋白共表达时可行（即顺式标记，ASAP-IDIC）；亦可在表达后固定细胞中外源加入抗体-酶融合蛋白进行反式标记（即反式标记，ASAP-IDIT）。ASAP-IDIT鉴定出448个以上已知及未报道的Lamin潜在互作蛋白。研究人员进一步应用ASAP-IDIT研究ALS（肌萎缩侧索硬化症）相关突变Profilin-1（PFN1）对其互作组的影响，发现与聚集倾向相关的蛋白质量控制（Protein Quality Control, PQC）相关蛋白被富集，且不同突变体呈现差异化的细胞定位聚集偏好——胞质聚集倾向突变体C71G和M114T邻近线粒体蛋白被富集，核聚集倾向突变体则富集核蛋白。上述结果表明ASAP-ID是邻近标记工具箱的有力补充，能以更小侵扰探测互作组的细微差异。
论文解读：ASAP-ID——基于小标签抗体招募的邻近标记新技术及其在蛋白互作组学与疾病相关突变研究中的应用
研究背景与立项依据
基于生物素连接酶（如BirA*衍生变体BioID、TurboID）或过氧化物酶APEX2的邻近标记（Proximity Labelling, PL）技术已成为解析细胞内蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）的核心手段，其原理是在活细胞中催化靶蛋白邻近（数纳米内）蛋白的生物素化，进而经链霉亲和素（Streptavidin）富集并进行质谱鉴定。然而传统PL方法要求将催化酶（TurboID约38 kDa，APEX2约27 kDa）直接融合至靶蛋白N端或C端，较大分子量的融合标签易引起空间位阻效应，干扰靶蛋白正确折叠、亚细胞定位、天然相互作用甚至功能——尤其当靶蛋白本身较小时（如15 kDa的Profilin-1），融合标签分子量甚至可能超过靶蛋白，导致严重假阴性或功能缺失。此外，传统方法无法对已固定的组织样本或内源蛋白（若无合适抗体）进行反式（in trans）标记。为解决上述问题，研究人员开发了ASAP-ID（Antibody and Small-tag Assembly on Proteins for Interaction Detection），通过将小表位标签（SunTag：19 aa；MoonTag：15 aa）融合于靶蛋白，再借助抗原-抗体高亲和力结合将酶（APEX2/TurboID）偶联至靶蛋白附近实现邻近标记，从而降低位阻干扰并拓展标记模式（含固定细胞in trans标记）。
主要关键技术方法
研究人员构建表达靶蛋白-小标签（SunTag或MoonTag）融合体及抗体(scFv或Nanobody)-酶(APEX2/TurboID)-GB1融合体的质粒，转染HEK293T及HeLa细胞。ASAP-IDIC（顺式）为共表达两者；ASAP-IDIT（反式）为先表达靶蛋白-标签融合体，甲醇或4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）固定后，加入经HA标签亲和纯化或粗提的scFv/Nanobody-APEX2进行孵育与生物素酚（Biotin-phenol）+H2O2催化标记。标记后细胞裂解，链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白，胰酶消化后经纳升液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS, Orbitrap Ascend）检测，MaxQuant搜库（UniProt人参考蛋白组），Perseus进行生信分析（LFQ强度log2转化、以内源性生物素化丙酮酸羧化酶Pyruvate Carboxylase, PC作归一化、t检验、k-means聚类、GO/KEGG富集）。免疫荧光染色验证定位与标记特异性，超分辨结构照明显微镜（Lattice SIM2）三维重构测量蛋白聚集体与细胞器距离。以人Lamin A为经典核膜标志物验证方法可行性，以野生型及ALS相关突变Profilin-1（PFN1: C71G, M114T, E117G, G118V）为对象研究互作组差异。
研究结果
Results — ASAP-ID可特异性标记靶蛋白邻近蛋白
原理验证显示SunTag-Lamin A与scFv-APEX2共表达（ASAP-IDIC）或固定后加scFv-APEX2（ASAP-IDIT，纯品或粗提液）均只在核膜Lamin A处出现链霉亲和素-488信号，无SunTag标签时不具特异性。MoonTag-Nanobody系统同样有效，证明ASAP-ID兼容不同表位/抗体对并可in trans操作。
Results — ASAP-IDIT应用于Lamin A互作组鉴定
以未标签Lamin A为对照，ASAP-IDIT（甲醇及PFA固定）与直接融合APEX2-Lamin A传统方法并行质谱分析。数据归一化采用内源性生物素化羧化酶（尤其是PC）而非中位肽段归一化，以避免背景夸大。PFA固定ASAP-IDIT鉴定出已知Lamin互作家族中61%（139/227），甲醇固定为25%，传统APEX2融合为31%，ASAP-IDIC为19.4%；三者富集已知互作者呈显著正相关（R2=0.56~0.62），GO富集核膜/核孔复合体条目。ASAP-IDIT总鉴定蛋白数较多（PFA固定达1961个），其中直接检测到生物素化修饰肽段的蛋白显著富集已知互作者，提高统计阈值可进一步提升特异性。表明ASAP-IDIT能有效捕获核纤层邻近蛋白且避免游离APEX2非特异性标记。
Results — PFN1变体在细胞内的定位特征
SunTag标签未改变WT PFN1弥散胞质分布及突变体聚集模式：WT与E117G呈弥散分布（E117G核质比略高）；C71G、M114T、G118V形成胞质或核内聚集体，聚集程度与核/胞质比例依C71G<M114T<G118V递增，证实SunTag未干扰PFN1生物学行为，适合小蛋白低侵扰标记。
Results — ASAP-IDIT揭示PFN1变体互作组差异
对WT及4种突变体PFN1-SunTag进行ASAP-IDIT质谱（3次生物学重复），鉴定978个富集蛋白，WT中重现5个已知PFN1互作蛋白（AKAP9, DOCK7, MON2, NF1, CYFIP1），其中4个在所有变体中保守富集。k-means聚类显示：Cluster 1与Cluster 3随聚集倾向增强而富集，含分子伴侣DNAJA1、DNAJC7、HSPA1A/HSPA8、STUB1(CHIP)、FAF1及蛋白酶体亚基，提示聚集体招募蛋白质量控制（PQC）机器；Cluster 11（E117G与G118V富集）74%为核蛋白（GOCC:0005634），涉及基因表达调控，反映核聚集突变可能干扰转录相关核内互作；Cluster 10（C71G与M114T富集）81%为线粒体外膜/基质蛋白（GOCC:0005739，如SDHA），超分辨显微证实C71G/M114T胞质聚集体距线粒体表面≤0.5 μm，表明胞质聚集使标记半径涵盖邻近线粒体，反映突变体亚细胞定位决定的互作组偏移。TDP-43亦随聚集倾向升高而富集，与PFN1突变致TDP-43错位聚集表型相符。
讨论部分总结（翻译研究结论）
本研究开发的ASAP-ID去除了将APEX2或TurboID直接融合至靶蛋白的需求，显著降低了对靶蛋白功能的空间位阻干扰。ASAP-IDIT允许在固定细胞中进行反式标记，拓展了传统邻近标记的应用场景。与基于抗靶蛋白一抗偶联酶的PL法相比，ASAP-ID依赖遗传编码的小表位标签，背景更易控制，且可适用于SunTag敲入动物模型组织样本。ASAP-ID的标记半径受固定后谷胱甘肽淬灭减弱及抗体-酶复合物空间延伸影响，实测有效标记范围可达亚微米级（与文献TSA-seq及固定细胞APEX2报道一致），部分归因于固定细胞自由基扩散受限减少及交联-解交联残留。PFA固定较甲醇更能真实反映活细胞邻近蛋白组成。应用于PFN1-ALS突变体研究揭示：聚集倾向越高的突变体越富集蛋白质量控制相关分子伴侣与蛋白酶体组分；C71G/M114T胞质聚集偏好导致线粒体邻近蛋白共标记，E117G/G118V核聚集偏好富集核内转录相关互作家族；不同亚细胞区室聚集可能通过差异化隔离互作伙伴介导各异病理机制。综上，ASAP-ID凭借小标签低侵扰、可in trans操作及兼容多酶/标签体系的特点，是邻近标记工具箱的有力增补，适于探测精细互作组差异及小分子量或位阻敏感蛋白的互作研究。该论文发表于《Molecular & Cellular Proteomics》或同等细胞分子/蛋白质组学期刊（原文出自Cell Press旗下Molecular系列期刊）。
