内吞型分层miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒：钙离子与microRNA的细胞内协同释放，以增强创伤性脑损伤的神经干细胞治疗效果

《Nano Today》：Endocytic hierarchical miRNA-CaCO?@PLGA nanoparticles: Intracellular Co-release of calcium ions /microRNA for enhanced traumatic brain injury neural stem cell therapy

　　

Zihan Yuan|Jinyang Gao|Liang Wang|Yao Zhang|Haofan Liu|Hui Wang|Yingchuan Chen|Jichuan Qiu|Shuting Wang|Yanqing Wang|Hong Liu

中国山东省济南市山东大学齐鲁医院生物医学工程学院晶体材料国家重点实验室，邮编250100

摘要

钙离子（Ca^2?+）和微小RNA-124（miR-124）已被证实能够促进神经干细胞（NSCs）的神经元分化，因此成为针对中枢神经系统疾病的治疗策略中的重要信号分子。然而，由于细胞膜屏障的存在，游离钙离子难以被细胞吸收，而微小RNA在生物环境中也容易降解。在此，我们通过纳米组装技术制备了分层结构的miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒，将miR-124封装在超小的碳酸钙纳米核中，再将其包裹在PLGA中，以此提高微小RNA的稳定性，并实现高效的细胞内钙离子输送。当NSCs吞噬这些纳米颗粒后，由于碳酸钙在酸性溶酶体环境中的分解，钙离子和miR-124会同时释放，从而产生双重促神经元生成效应。体外实验表明，吞噬了miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒的NSCs的神经元分化效率可达32.4%，远高于自然分化的16.7%，并且还能形成具有信号传导功能的神经元网络。在创伤性脑损伤小鼠模型中，将吞噬了该纳米颗粒的NSCs移植到损伤部位后，动物的神经功能得到了显著恢复。通过莫里斯水迷宫、新物体识别和旋转棒测试等行为学评估，发现经过治疗的脑损伤小鼠在32天后其认知和运动功能已接近健康对照组水平。总体而言，本研究提出了一种促进NSCs快速分化为神经元的新策略，显示出其在治疗脑损伤方面的巨大潜力。

引言

创伤性脑损伤是全球导致残疾和死亡的主要原因之一。[1], [2] 损伤发生后，受损的神经元会被清除，而胶质细胞则会大量增殖形成疤痕，从而导致损伤部位的严重神经功能障碍。[3], [4] 目前，脑损伤的临床治疗主要侧重于症状缓解和康复训练，但由于成年中枢神经系统的自我更新和再生能力有限，目前尚无有效方法能够逆转或延缓疾病进展。[5], [6] 基于神经干细胞的治疗策略被认为是一种治疗脑损伤的有效途径。[7], [8] 这种方法主要是通过将NSCs分化为新的神经元，以替代受损细胞，从而重建神经回路并恢复大脑功能。[9], [10] 然而，将NSC疗法应用于临床仍面临诸多挑战，因为移植到的NSCs在受损且存在炎症的微环境中难以完全向神经元方向分化，反而更容易向星形胶质细胞方向发展，这会影响神经元的替代以及功能整合。[11], [12], [13], [14]

为克服这些限制，人们研究了多种神经营养因子、小分子物质、核酸调控剂以及生物活性离子，试图引导NSCs向神经元方向分化。[15], [16], [17], [18], [19], [20], [21] 例如，黄等人开发了一种纳米制剂介导的NSC治疗策略，通过同时递送SOX9 siRNA表达质粒和视黄酸来促进神经元再生，这一研究凸显了结合核酸和小分子信号分子来调控NSC命运的潜在价值。[22] 微小RNA在调节基因表达和决定细胞命运方面起着关键作用。[23], [24] 例如，高度富集在成熟神经系统中的miR?124就是一种能够促进神经元分化的关键调控因子。[25] 不过，直接使用微小RNA存在诸多局限性：它容易被核酸酶降解，且由于其带负电荷，无法自由穿过细胞膜。[26] 在各种离子信号分子中，钙离子是一种多功能的信号传递分子，可通过钙信号通路调节NSCs的增殖、分化和迁移。[27], [28], [29] 然而，游离钙离子很难被细胞有效吸收，而且也难以精确控制细胞内的钙离子浓度。[30], [31] 此前有研究采用简单的杂交方法，将铜离子与木犀草素结合成纳米复合物，以此解决金属离子吸收和小分子化合物易降解的问题。[32] 这种方法为金属离子和小分子化合物的协同递送提供了一种可行的策略。

在本研究中，我们设计并制备了可用于同时递送钙离子和miR?124的分层结构纳米颗粒，以此提供协同信号，促使NSCs向神经元方向分化。具体而言，我们将预先混合了miR?124的氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液引入双乳液体系的内水相中，在原位生成碳酸钙，从而形成负载了miR?124的碳酸钙纳米核。随后，我们选用具有优异生物相容性且生物降解性能可调控的PLGA作为外壳材料，将这些纳米核包裹起来，最终得到了分层结构的miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒（图1a）。当NSCs吞噬这些纳米颗粒后，碳酸钙纳米核会在酸性的溶酶体环境中分解，从而使钙离子和miR?124同步释放到细胞内，进而加速NSCs向神经元方向的分化（图1b）。为了验证这一策略的有效性，我们对纳米颗粒的制备过程及细胞内递送行为进行了系统分析，并在体外检测了NSCs的神经元分化效率。此外，在小鼠脑损伤模型中，我们将吞噬了miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒的NSCs移植到损伤部位，通过组织学和行为学分析评估了其在重建神经元网络以及恢复认知和运动功能方面的治疗效果（图1b）。总体而言，本研究建立了一种具有实际应用价值的纳米递送策略，有助于提升NSCs的神经元分化能力，为脑损伤的治疗提供新的思路。

章节节选

miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒的合成

miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒是通过改进的双乳液法合成的。[35] 简单来说，首先将miR?124溶解在0.625?M的碳酸氢钠溶液中，而PLGA则溶解在浓度为13.3?mg?mL^?1的二氯甲烷中。接着，将1?mL的miR?124溶液与3?mL的PLGA溶液混合，然后使用超声探头进行5分钟的超声处理（工作频率为40?kHz，输出功率为250?W，脉冲时间为3秒开启，7秒关闭），这样就制得了含有miR?124的乳液。

分层结构miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒的设计与表征

我们通过碳酸钙辅助的双乳液法，将miR?124封装在共聚物PLGA中（见图1a，详细内容见实验部分）。扫描电子显微镜图像显示，miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒和CaCO?@PLGA纳米颗粒都具有球形结构（见图2a）。透射电子显微镜进一步观察发现，这些纳米颗粒内部还存在多个对比度更高的较小颗粒，这些颗粒应该是形成在纳米颗粒内部的碳酸钙纳米晶体。

结论

总之，我们通过纳米组装技术制备出了分层结构的miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒，这种颗粒不仅能够克服细胞膜屏障对钙离子细胞内吸收的限制，还能保护微小RNA免于过早降解。这些具有优异生物相容性的miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒会被NSCs吞噬并进入溶酶体，在酸性环境下分解，从而释放出钙离子和微小RNA。我们的研究证明，miRNA-CaCO?@PLGA纳米颗粒是一种非常有效的

CRediT作者贡献说明

Hui Wang：验证，正式分析。Yingchuan Chen：验证。Jichuan Qiu：写作——审阅与编辑，指导。Shuting Wang：写作——审阅与编辑。Yao Zhang：方法学，正式分析。Haofan Liu：验证，方法学。Liang Wang：资源获取，研究实施，正式分析。Yanqing Wang：写作——审阅与编辑，资源获取，资金筹集。Hong Liu：写作——审阅与编辑，指导，资源获取，资金筹集，概念构思。Zihan Yuan：写作——

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究部分得到了中国国家自然科学基金（编号：52202351、T2321004、82201383）、山东省自然科学基金（编号：ZR2024ZD13、ZR2025MS1247）以及山东省重大科技攻关项目（编号：2024ZLGX01）的支持。