穿透血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的树枝状大分子(dendrimer)用于减轻脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia–reperfusion injury, IRI)

《Nano Today》：Blood–brain barrier permeating dendrimers for alleviation of cerebral ischemia–reperfusion injury

　　

摘要：缺血-再灌注损伤（ischemia–reperfusion injury, IRI）是缺血性卒中再灌注治疗（如静脉溶栓或机械取栓）后神经功能恢复不全的主要原因。再灌注可触发过量活性氧及氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）生成并促进炎性细胞募集，导致继发性脑损伤。尽管多种神经保护及免疫调节药物被用于减轻IRI，但其脑实质蓄积受血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）限制，脑穿透能力及治疗效力不足。为克服此障碍，研究人员构建了具有长循环特性及RONS响应性聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）壳层的RONS清除型第4代树枝状大分子G4?PB?PEG（RONS?responsive PEGylated polythioether dendrimer）。在富含过量RONS的缺血微环境中，刺激响应性PEG脱屏蔽（deshielding）促进BBB穿透及病灶选择性蓄积，从而高效清除病理性RONS。在短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）小鼠模型中，静脉给予G4?PB?PEG后在脑梗死区呈优先蓄积；通过有效清除RONS并减轻神经炎症反应，G4?PB?PEG显著减小梗死体积及神经炎症标志物水平，改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score, mNSS）定量显示神经功能结局亦明显改善。结果表明G4?PB?PEG通过促进BBB穿透及病灶选择性蓄积有效缓解脑IRI，具有强神经保护作用，值得进一步临床转化评估。

论文解读：穿透血脑屏障的RONS响应性树枝状大分子G4?PB?PEG减轻脑缺血?再灌注损伤

该文发表于《Nano Today》，由中国科学技术大学附属第一医院神经内科等单位合作完成，通讯作者为Xinfeng Liu、Xun Sun与Zhenya Shen等。缺血性卒中约占全部卒中的65.3%，静脉溶栓和机械取栓是目前血管再通的标准疗法，但再灌注常诱发缺血?再灌注损伤（IRI），其特征是活性氧及氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）爆发性产生，引发氧化损伤及神经炎症级联放大，限制患者神经功能恢复。传统抗氧化剂（如依达拉奉edaravone）因BBB穿透能力差、脑内蓄积不足而疗效受限；已有纳米载体（胶束、脂质体、无机纳米粒）也存在体内稳定性差、BBB通透效率低及安全性顾虑等问题。因此，开发可经系统给药主动穿透BBB并在IRI病灶选择性富集、兼具本征RONS清除能力的纳米平台仍是未满足的临床需求。本研究设计并合成一种含硫醚内核、苯硼酸酯（phenylboronic acid ester, PBA ester）连接PEG壳的第4代聚硫醚树枝状大分子（generation?4 polythioether dendrimer, G4?PB?PEG），利用缺血区高RONS触发苯硼酸酯键断裂致PEG脱屏蔽，暴露表面多羟基而增强BBB穿透及病灶滞留，同时由硫醚骨架直接清除多种RONS，并调控小胶质细胞极化以减轻神经炎症，最终在tMCAO小鼠模型中验证其减轻脑梗死、改善神经功能及生存的作用。

主要关键技术方法： 研究人员以季戊四醇为核，通过发散法交替进行丙烯酸酯化与1?硫代甘油（1?thioglycerol, 1?TG）的碱催化硫醇?迈克尔加成（thiol?Michael addition）逐步合成G1至G4代多羟基树枝状大分子（G4?64OH），再与4?(羟甲基)苯硼酸形成硼酸酯键得G4?PB?32OH，残余羟基与mPEG?COOH（2 kDa）通过DIC/DMAP催化酯化得G4?PB?PEG；采用尺寸排阻色谱（SEC/GPC）、¹H NMR、¹¹B NMR、MALDI?TOF MS、动态光散射（DLS）及透射电镜（TEM）进行结构表征与胶体稳定性评价；体外RONS清除能力通过DCFH?DA（H₂O₂）、DHE（O₂^•?）、Griess（NO）、焦性没食子红褪色（ONOO^?）及电子顺磁共振（EPR，·OH和DPPH）等方法测定；建立C57BL/6N小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）IRI模型，尾静脉注射Cy5标记的各制剂，通过活体成像系统（IVIS）及免疫荧光分析脑及主要脏器分布；建立小鼠脑微血管内皮细胞（MBMEC）与PC12细胞共培养Transwell?血脑屏障模型评估H₂O₂预处理前后跨内皮转运；治疗后取脑行二氢乙锭（DHE）染色、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）检测、小胶质细胞M1/M2表型免疫荧光与RT?qPCR、TTC梗死体积测量、TUNEL凋亡检测、改良神经功能缺损评分（mNSS）及Kaplan?Meier生存分析；部分实验进行血浆及脑组织的药代动力学AUC计算。

研究结果

Synthesis of G4?PB?PEG dendrimers（G4?PB?PEG树枝状大分子的合成）： 通过发散式逐步酯化与硫醇?迈克尔加成成功制备G4?64OH，再经苯硼酸化及mPEG?COOH酯化获得G4?PB?PEG；SEC显示各代分子量递增且多分散指数窄，¹H NMR证实预期结构及PEG化度，表明该合成路线可重复且具放大潜力。

Physicochemical characterization and colloidal stability of G4?PB?PEG（G4?PB?PEG的理化表征与胶体稳定性）： 未修饰G4?64OH在水中易聚集（流体力学直径约75.0 nm），PEG化后G4?PEG与G4?PB?PEG分别为约18.2 nm与20.7 nm，ζ电位近中性，TEM呈均匀形貌；在PBS及含10%胎牛血清（FBS）中尺寸稳定不聚集。Nile Red包裹释放实验显示H₂O₂浓度依赖性地促使探针释放，表明RONS可氧化硫醚破坏疏水内核触发响应。G4?PB?PEG对H₂O₂、O₂^•?、·OH、NO及ONOO^?均有显著清除作用（强于无苯硼酸酯的G4?PEG），证实其广谱RONS清除能力源于硫醚骨架及苯硼酸酯基团协同作用。

Brain accumulation of G4?PB?PEG in mice after intravenous administration（静脉给药后G4?PB?PEG在小鼠脑内的蓄积）： tMCAO模型再灌注时静脉给予Cy5标记制剂，12 h后IVIS显示G4?PB?PEG与PEG?b?PLGA纳米粒在缺血脑显著蓄积，G4?PEG中度蓄积，游离Cy5及5 nm金纳米粒几无信号；健康小鼠各纳米制剂脑内均无显著蓄积。脑切片定量分析示G4?PB?PEG在缺血半球荧光强度显著高于对侧及健康对照脑，证实其病理依赖性的病灶选择性脑内富集。

Mechanism of G4?PB?PEG penetration across the BBB（G4?PB?PEG穿透BBB的机制）： DLS与TEM显示低浓度H₂O₂处理致G4?PB?PEG粒径增大（PEG脱屏蔽诱导聚集），¹¹B NMR证明苯硼酸酯键被氧化裂解。G4?PEG与G4?PB?PEG血浆药代AUC相当，但G4?PB?PEG脑AUC约为G4?PEG两倍，脑/血浆AUC比更高。免疫荧光见PEG?b?PLGA基本滞留于CD31⁺血管腔，G4?PEG少量外渗，G4?PB?PEG大量分布于血管外脑实质，表明RONS触发PEG脱屏蔽暴露多羟基表面促进跨BBB及实质穿透，而非单纯被动渗漏。体外MBMEC/PC12共培养Transwell?模型证实仅经H₂O₂预处理的G4?PB?PEG能显著跨内皮转运并被PC12摄取，支持脱屏蔽增强跨BBB转运机制。

Validation of deshielding?enhanced transport using an in vitro BBB model（利用体外BBB模型验证脱屏蔽增强转运）： 经H₂O₂模拟氧化微环境预处理后G4?PB?PEG可穿过完整紧密连接的MBMEC单层到达下室并被PC12细胞及活化BV2小胶质细胞摄取，未预处理组及其他对照纳米粒均无显著转运，进一步确认RONS响应性PEG脱屏蔽是其BBB穿透的关键。

G4?PB?PEG scavenged RONS and modulated the inflammatory microenvironment in vivo（G4?PB?PEG在体内清除RONS并调节炎症微环境）： tMCAO再灌注即刻静脉给药，24 h后G4?PB?PEG组脑内DHE阳性区显著小于生理盐水、依布硒（ebselen）及G4?PEG组；SOD活性保留、MDA水平降低。小胶质细胞免疫荧光示M1标志物CD16/32下调、M2标志物CD206上调；RT?qPCR显示促炎因子（TNF?α、IL?6、iNOS、IL?1β）mRNA降低，抗炎/修复因子（Arg?1、CD206、IL?10）升高，说明G4?PB?PEG通过清除RONS抑制氧化爆发，进而促使小胶质细胞由M1向M2表型偏移，重塑缺血区炎症微环境。

G4?PB?PEG treatment promoted neuroprotection and functional recovery after ischemic stroke（G4?PB?PEG治疗促进缺血性脑卒中后神经保护与功能恢复）： TTC染色示G4?PB?PEG将梗死体积降至约8.7%（生理盐水组23.5%，依布硒21.4%，G4?PEG 17.3%），呈剂量依赖性；延迟至再灌注后3 h给药仍显著缩小梗死体积。缺血半暗带NeuN染色存活神经元增多，TUNEL⁺凋亡细胞减少。纵向mNSS评分G4?PB?PEG组神经功能恢复更快更完全，Kaplan?Meier生存曲线显示生存率提高。血清肝肾功能指标及主要脏器H&E染色未见明显毒性，提示良好生物相容性。

讨论与结论翻译（Conclusion部分浓缩总结）： 研究人员开发了由聚硫醚内核、RONS响应性苯硼酸苯酯连接PEG壳组成的RONS清除型第4代树枝状大分子G4?PB?PEG，通过交替硫醇?迈克尔加成与酯化合成，具备放大与转化潜力。体内外证据表明缺血区过量RONS氧化裂解苯硼酸酯键致PEG脱屏蔽，暴露多羟基核心，促进病灶选择性脑蓄积与BBB穿透；G4?PB?PEG广谱清除RONS并减轻下游神经炎症（促M1→M2小胶质细胞极化），在tMCAO小鼠中显著降低梗死体积、减少神经元凋亡、改善运动功能与生存，且在再灌注后3 h延迟给药仍有效，系统安全性良好。该研究提出一种病理微环境响应"脱屏蔽"策略整合病灶靶向递送与本征抗氧化/免疫调节功能，为缺血性卒中抗氧化应激?神经炎症联合治疗提供了具转化前景的纳米平台。