Vero细胞适应性传染性支气管炎病毒株rHV80表现出高免疫原性与广泛组织嗜性

《Poultry Science》：The Vero Cell-Adapted Infectious Bronchitis Virus Strain rHV80 Exhibits High Immunogenicity and Broad Tissue Tropism

　　

传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）是一种自然感染鸡的冠状病毒（coronavirus），可对包括呼吸道在内的多种组织和器官造成损伤。疫苗接种仍然是预防和控制鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）的主要方法。基于细胞的减毒活疫苗研发进展受限，其关键障碍在于IBV在体外复制能力较差。研究人员在既往工作中以rH120毒株为亲本，经驯化获得可在Vero细胞中高效复制的IBV毒株HV80；随后利用反向遗传学（reverse genetics）构建了其感染性克隆rHV80。为评估其作为细胞适应性减毒活疫苗的潜力，研究人员在1日龄SPF雏鸡中评价了rHV80毒株的免疫原性。结果发现，该毒株在免疫或感染后均可诱导强烈免疫应答。然而，连续传代扩展了该毒株的组织嗜性。与亲本毒株相比，rHV80毒株可额外感染胸肌、心脏和睾丸等组织，并可造成脑部病变，进而导致雏鸡出现神经症状及感染后期死亡，从而削弱其作为减毒活疫苗的安全性。rHV80病毒在体内的安全性与免疫原性评估表明，尽管其具有有效的免疫保护作用，但传代与驯化所致的组织嗜性扩展及潜在神经毒性仍带来风险。本研究表明，将IBV体外细胞适应株用作减毒活疫苗种毒可能存在安全隐患；同时，相关结果也为IBV减毒活疫苗的理性研发提供了理论基础。

该研究发表于《Poultry Science》，围绕Vero细胞适应性鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）重组株rHV80的免疫原性、安全性及组织嗜性变化展开系统评估。研究背景在于，IBV属于γ-冠状病毒（gamma-coronavirus），可在鸡体内引发呼吸道、肾脏、消化道、法氏囊、肌肉及生殖系统等多器官损伤，是家禽业重要病原之一。当前IB防控仍主要依赖疫苗，尤其是减毒活疫苗。此类疫苗因可模拟天然感染，通常具有较强免疫原性和较广保护谱，在实际生产中应用广泛。然而，传统减毒活疫苗多依赖鸡胚或鸡胚肾细胞连续传代获得，其生产过程受SPF鸡胚供应、劳动强度和扩产效率等限制。相比之下，基于细胞培养的疫苗制造更具规模化和标准化优势，Vero细胞亦因遗传稳定、适于大规模培养且为多种病毒疫苗常用基质而受到关注。问题在于，除个别实验室株外，绝大多数IBV难以在Vero细胞中高效复制，因此细胞基质IBV减毒活疫苗的研发长期受阻。

研究人员此前已将疫苗株H120的感染性克隆rH120经Vero细胞连续驯化，获得能在Vero细胞高效复制的HV80株，并进一步构建感染性克隆rHV80。本研究开展的核心目的，是在天然宿主雏鸡体内验证这一Vero细胞适应株是否仍保有良好免疫原性，以及其长期传代后是否出现影响疫苗安全性的组织嗜性改变。研究结果显示，rHV80虽保持较高免疫原性，能够诱导较强体液免疫反应，但同时出现了明显扩展的组织嗜性，除呼吸道外，还可在肺、胸肌、心脏、睾丸和脑组织中高效分布并造成病理损伤，尤其表现出神经组织侵袭性和神经毒性。这一发现直接指出，细胞适应和传代驯化虽然解决了IBV在Vero细胞中的复制问题，但可能引入新的生物安全风险，因此不能仅以复制效率和免疫效果作为疫苗候选株评价标准，而必须同步严格审查其体内组织分布、致病谱和神经安全性。这对于今后理性设计IBV减毒活疫苗、筛查关键突变位点以及构建更安全的基因工程疫苗骨架具有重要意义。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：以1日龄SPF雏鸡为动物模型，设置不同培养基质来源病毒和不同免疫剂量组，经滴鼻与滴眼途径接种；通过间接ELISA和微量中和（microneutralization，MN）试验检测体液免疫水平；在攻毒后采用临床症状监测、喷嚏计数和气管环纤毛活动抑制评分评价致病性；采集气管、肺、胸肌、心脏、睾丸/卵巢、脑及其他器官，利用RT-qPCR检测病毒RNA载量，结合HE染色与免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）分析组织损伤与病毒抗原分布；同时通过咽拭子和泄殖腔拭子检测病毒排毒动态。

在研究结果部分，论文首先以“The level of humoral immune response induced by the rHV80 strain in chicks”为题，说明rHV80在雏鸡中可诱导较强体液免疫。其下“Effects of different culture substrates on humoral immunity induction by the rHV80 strain”显示，来自尿囊液、CK细胞和Vero细胞的rHV80制备物均可诱导抗体应答，且在28 d时细胞基质来源rHV80组抗体水平高于rH120组，提示Vero细胞适应并未削弱其免疫原性。“The effective dose for the rHV80 strain to induce good humoral immunity”进一步表明，在10⁴–10⁶ TCID₅₀范围内，rHV80均可诱导良好体液反应，其中10⁵ TCID₅₀组在28 d时表现较高抗体水平，说明该株具有较稳定的免疫诱导能力。

随后，“Clinical symptoms of chicks infected with the rHV80 strain”部分总结了感染后的临床表现。与rH120相比，rHV80早期呼吸道症状较轻，但雏鸡普遍出现精神沉郁、发热和羽毛蓬乱；在感染后期则出现头颈下垂、共济失调、转圈、抽搐及死亡等神经症状，且PBS对照组和rH120组均无类似表现。这说明rHV80的致病谱已不再局限于传统呼吸道损伤，而是出现了显著的神经系统相关危害。

在“RNA distribution and induced tissue damage of the rHV80 strain in different tissues of infected chicks”这一核心结果模块中，研究人员系统描述了多个器官中的病毒分布与病理学后果。“Damage of the rHV80 strain to the respiratory system”显示，rHV80在气管中的病毒载量低于rH120，对气管纤毛的抑制作用也较弱，提示其上呼吸道致病性下降；但其在肺组织中的病毒载量高于rH120，并伴有更明显的肺部病变和抗原分布，说明其对下呼吸道特别是肺组织的感染能力增强。“Muscle tissue damage in chickens infected with the rHV80 strain”表明，rHV80在胸肌和心脏中的RNA水平明显高于rH120，并可在肌细胞及心肌组织中检出病毒抗原，心脏还可见局灶性心肌坏死及少量淋巴细胞浸润，说明该株获得了对肌肉组织的感染与损伤能力。“Colonization and damage of the rHV80 strain in the reproductive system of chicks”指出，rHV80在7 dpi时于睾丸/卵巢中的病毒RNA水平显著升高，睾丸出现局灶性曲细精管坏死、生精细胞脱落及局部炎性浸润，而rH120未见明显病变，提示rHV80具有更强的生殖系统，尤其是睾丸组织嗜性。“Colonization of the rHV80 strain in brain tissue and its damage to the nervous system”是该研究最重要的安全性证据之一：rHV80在脑组织中的病毒RNA在各时间点均明显高于rH120，HE染色可见神经元局灶性变性，IHC进一步证实脑组织中存在病毒抗原，这与后期出现的神经症状和死亡相一致，证实该株具有明确的神经嗜性（neurotropism）和神经毒性（neurotoxicity）。“Distribution of the viral genome in other tissues and organs”进一步显示，两株病毒均可感染胰腺和法氏囊并造成病理损伤，其中rHV80在感染早期更易进入血流，提示其全身播散能力增强；而rH120在法氏囊中的感染水平反而较高，说明两者组织偏好并不完全一致。

在“Viral shedding of chicks infected with the rHV80 strain”部分，研究人员通过咽拭子和泄殖腔拭子RT-qPCR分析排毒规律。结果显示，咽拭子排毒在7 dpi达到峰值，rHV80组于7和14 dpi的咽部排毒量低于rH120组；泄殖腔排毒在14 dpi达到高峰，两株之间无显著差异。这提示rHV80虽具有更广组织嗜性，但整体排毒模式并未发生特别显著的异常延长或增高。

讨论部分围绕“高免疫原性”与“安全性下降”之间的矛盾展开。研究人员首先确认，Vero细胞作为疫苗生产基质并未削弱rHV80诱导体液免疫的能力，这为细胞基质IBV疫苗研发提供了支持。另一方面，连续传代和细胞适应带来的基因变异，尤其是S蛋白（spike protein）相关氨基酸替换，可能改变病毒组织嗜性。结合既往研究，研究人员指出HV80在驯化过程中S基因累计发生9个氨基酸替换，并形成高效的S2’裂解位点弗林（furin）识别基序，这可能与其组织嗜性扩展和神经毒性出现密切相关。论文还指出，rHV80对气管纤毛的损伤减弱而对肺组织侵袭增强，提示不同呼吸道部位的受体或蛋白酶环境差异，可能共同塑造了其新的致病特征。此外，胰腺中较高病毒载量及明显病变提示IBV可能对富含胰蛋白酶（trypsin）等蛋白酶的组织具有特殊亲和性。整体而言，研究人员通过体内多组织定量、病理和抗原检测的证据链，证明rHV80虽可作为强免疫原，但其作为减毒活疫苗种毒仍存在不可忽视的安全隐患。

研究结论部分可概括并翻译为：总之，rHV80毒株具有较高免疫原性，并表现出可接受的病毒排毒水平，但其扩展的组织嗜性削弱了其作为减毒活疫苗的安全性。未来需要针对病毒S基因进行进一步改造，以明确导致组织嗜性扩展的关键突变，并评估rHV80毒株是否能够作为基因工程疫苗的基因组骨架。