用于感染创面愈合的双向氧化还原调控碳化钒集成智能微针

《Redox Biology》：Bidirectional Redox-Modulating Vanadium Carbide-Integrated Smart Microneedles for Infected Wound Healing

　　

创面愈合长期受困于固有的活性氧（ROS）悖论：升高的ROS对细菌防御至关重要，但过量的ROS水平会阻碍炎症消退和组织修复。传统单组分纳米材料缺乏双向ROS调控能力，而多药联合策略则存在调控模式复杂、稳定性差以及抗菌耐药性等问题——所有这些都限制了其临床转化。为应对这些挑战，研究人员开发了一种碳化钒（V₄C₃）-碘烯（Ine）@聚乙烯醇（PVA）智能微针系统。值得注意的是，该系统中的V₄C₃具有固有的双功能性：不仅可在光照下产生ROS以实现光动力抗菌治疗，还能在光照后清除过量ROS。在Ine和PVA微针的进一步增效下，该系统的功能适应性和生物相容性得到提升，形成了一个具有优异机械强度、自适应创面贴合性以及激光可控开关式ROS调控的治疗平台。体外和体内实验证实了其强效的抗菌活性、诱导M2巨噬细胞极化的能力以及降低促炎细胞因子表达的能力，从而缓解炎症并加速创面愈合。通过利用V₄C₃的双功能性，并结合微针递送和激光调控，这一简化而智能的创面愈合平台解决了ROS悖论，避免了耐药性等问题，具有巨大的临床转化潜力。

创面愈合是一个高度复杂的生物学过程，依次经历病原体清除（炎症期的核心组成部分）、抗炎调节和组织再生三个阶段。其中，病原体清除与抗炎调节尤为关键，但两者对ROS水平存在矛盾性需求：升高的ROS水平对于高效根除病原体必不可少，而在抗炎期则需要清除ROS以抑制促炎信号并防止过度组织损伤。这一内在矛盾使得传统单组分纳米材料无法同时实现高效抗菌和抗炎效果，最终限制了创面愈合的整体效率。

为克服这一瓶颈，研究逐渐转向多组分复合系统，试图通过联合给药或序贯释放模式来协调抗菌与抗炎功能。然而，这类系统普遍存在调控精度不足、长期使用可能诱导细菌耐药性等缺陷，严重阻碍了其临床转化。此外，现有的一些多组分系统往往依赖多种功能单元的简单叠加，增加了制备难度和成本，进一步影响了治疗效果。相对于这些系统，具有结构简单、作用机制直接可控的多功能材料为先进创面治疗策略提供了新思路。

在氧化还原活性无机材料中，传统金属氮化物系统和金属碳化物是两个相关但结构不同的平台。与氮化物系统相比，金属碳化物具有导电的金属-碳框架和丰富的表面末端，特别有利于光触发电子转移和类酶ROS调控。在碳化物类别中，碳化物MXenes是更广泛的MXene家族中重要的二维金属碳化物，因其独特的层状结构、丰富的表面官能团以及优异的光热和电学性质而在生物医学领域受到广泛关注。具体而言，V₄C₃表现出有前景的双向ROS调控双功能特性——在近红外（NIR）激光照射下，其强大的电子转移能力可高效产生超氧阴离子（O₂^·-）等ROS，实现不依赖常规抗生素的光动力抗菌活性，从根本上避免耐药性风险；在无激光照射时，V₄C₃固有地具有类酶性质，可持续清除多种ROS并调节炎症因子表达，为抗炎修复提供支持。

然而，尽管V₄C₃的双功能特性令人振奋，其在复杂创面微环境中的效力仍受到纳米材料轻微固有毒性及催化表面不稳定性的限制。将V₄C₃与合适的辅助功能材料结合构建异质结已被证明是有前景的优化策略。在众多具有创面微环境响应特性的生物医学材料中，Ine因其独特性质而脱颖而出。作为元素碘的纳米片形式，Ine可与V₄C₃形成稳定的异质结构，并通过创面微环境响应性有效规避传统抗菌剂易诱导耐药性或导致脱靶毒性的缺点。通过H₂O₂响应性碘氧化还原反应，Ine相关的碘/碘化物物种可消耗感染创面微环境中过量的H₂O₂并生成杀菌性碘物种，主要是碘和次碘酸（HIO），这些碘物种可氧化细菌膜成分和细胞内生物分子，从而破坏细菌完整性并增强抗菌活性。此外，Ine还有助于缓解创面的局部氧化应激损伤。

值得注意的是，若无适当的递送平台，治疗剂难以发挥疗效。近年来，水凝胶微针作为新兴透皮递送平台，具有精准递送能力和独特的创面适应潜力。然而，其临床转化受限于传统水凝胶材料固有的机械强度缺陷，这阻碍了对皮肤屏障的有效穿透。研究表明，PVA水凝胶可与多种离子进行盐析改性以按需调整其机械强度，有效解决了传统水凝胶微针插入时易碎、透皮效率低等技术瓶颈，同时仍保留软化贴合创面的功能。

基于此，研究人员构建了V₄C₃-Ine@PVA智能微针系统，通过双功能组分实现ROS的精准调控，从而高效解决了创面愈合领域长期存在的ROS悖论。在该平台中，V₄C₃-Ine作为核心ROS调控材料，实现了激光可控的ROS调节：激光照射下，V₄C₃高效产生ROS以发挥强效杀菌活性，同时Ine响应创面微环境中的高H₂O₂水平，原位产生活性碘和次碘酸等抗菌活性物种，协同增强杀菌效果；无激光刺激时，V₄C₃-Ine通过多种抗氧化途径自发消除过量ROS，包括V₄C₃的超氧化物歧化酶（SOD）样和过氧化氢酶（CAT）样酶模拟活性、其直接清除羟基自由基的能力，以及Ine的H₂O₂响应性氧化还原反应，从而缓解炎症反应。值得关注的是，该响应过程中产生的碘可有效软化PVA着水凝胶基质，使微针实现与不规则创面床的紧密贴合，从而促进功能组分的局部滞留和持续释放。

该研究采用的关键技术方法主要包括：通过氢氟酸刻蚀和四甲基氢氧化铵辅助剥离制备V₄C₃纳米片，液相剥离法制备Ine纳米片，溶液相自组装构建V₄C₃-Ine异质结构；采用反复冻融法结合真空辅助脱气制备PVA水凝胶微针，并通过Na₂SO₄溶液浸泡实现盐析增强以提高机械强度；利用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、原子力显微镜（AFM）等对材料形貌、结构和组成进行表征；采用ABTS·⁺、PTIO·自由基及H₂O₂清除实验评价抗氧化能力，利用磺胺比色法检测超氧阴离子生成能力，通过交替循环实验验证ROS调控的可重复性和可控性；以1064 nm激光评估光热性能；通过CCK-8、活/死细胞染色、划痕实验、DCFH-DA荧光探针、JC-1线粒体膜电位检测等方法评价体外生物安全性、抗氧化和抗炎性能；以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌为对象，通过菌落计数、SYTO9/PI活/死染色、结晶紫生物膜染色、SEM形态学观察、流式细胞术等方法评价体外抗菌和抗生物膜活性；建立小鼠MRSA感染全层皮肤创面模型，通过创面拍照、细菌计数、组织学染色（H&E、Masson三色染色）、免疫组化（TNF-α、CD31）、流式细胞术检测巨噬细胞极化、二氢溴化乙啶（DHE）ROS染色及主要脏器和血清生化分析评价体内疗效和安全性。

**V₄C₃-Ine水凝胶微针的合成与表征**

V₄C₃-Ine异质结构通过溶液相自组装策略制备：首先以HF刻蚀V₄AlC₃粉末，经TMAOH辅助剥离、超声及梯度离心获得少层V₄C₃纳米片；将块状碘在水中超声剥离得到Ine纳米片；两者按1:2体积比混合，经超声和磁力搅拌形成稳定异质结构分散液，离心纯化后获得V₄C₃-Ine。TEM图像显示V₄C₃-Ine呈片状薄层结构，元素映射证实V、C、I均匀分布，AFM表征显示其厚度为1-4 nm。XRD分析表明复合物保留了V₄C₃的特征衍射峰，并检测到归属于结晶碘的额外衍射峰。XPS分析证实I以I⁰形式存在，V呈现混合氧化态，这种部分表面氧化现象预期可增强V₄C₃的ROS清除能力。长期储存后的TEM表征显示V₄C₃-Ine仍保持典型片状形貌，无明显结构坍塌或严重聚集，表明异质结构具有良好的形貌稳定性。

PVA经实验验证可有效改善V₄C₃-Ine的分散性。所制备的微针贴片包含10×10微针阵列，锥形针高600 μm、基底直径230 μm、针间距1 mm，SEM证实其均匀的锥形形貌。ICP-OES分析显示每片微针贴片平均负载V₄C₃-Ine 60.212 μg，其中V₄C₃和Ine的质量分数分别为68.655%和31.345%。机械性能方面，原始PVA水凝胶微针强度不足，无法有效穿透皮肤；Na₂SO₄浸泡后离子交联显著增强其机械强度，可实现猪皮肤的有效插入。值得注意的是，插入后微针尖端强度减弱，这归因于碘离子对PVA盐析过程的抑制作用及水凝胶网络离子相互作用的降低，该特性赋予微针初始刚性（皮肤穿透）和插入后柔性（体内药物释放）的双重优势。

**V₄C₃-Ine异质结构的ROS调控与光热性能**

紫外吸收光谱测量证实V₄C₃-Ine复合物具有强光吸收能力，使其在激光照射下兼具光热和光动力响应性。磺胺比色法检测显示，随浓度从0.1 mg/mL增至1.0 mg/mL，530 nm处吸光度逐渐增强，表明激光照射下高效产生超氧化物。ABTS·⁺和PTIO·清除实验显示，V₄C₃-Ine具有优异的抗氧化性能，且呈浓度依赖性。TMB用于验证H₂O₂清除效果，随V₄C₃-Ine浓度增加，652 nm处吸光度逐渐降低，证明其H₂O₂清除活性具有浓度依赖性。交替ROS产生/清除循环实验表明，V₄C₃-Ine在五个连续循环中保持相对稳定的ROS产生和清除能力。高分辨V 2p XPS光谱显示激光诱导V价态发生再分布并在照射后24 h部分恢复，表明多价V位点动态参与电子转移过程，支持V₄C₃-Ine的纳米酶样氧化还原调控行为。此外，储存后的V₄C₃-Ine仍保持可观的ROS产生能力和对多种自由基的有效清除活性。

光热性能方面，V₄C₃-Ine分散液表现出明显的光热加热效应，具有浓度依赖性和功率依赖性，重复开关照射循环产生一致的加热曲线，计算得到的光热转换效率达37.99%，证明异质结构具有稳健的光热性能和稳定性。

**V₄C₃-Ine微针的体外生物安全性、抗氧化和抗炎性能**

CCK-8实验显示高浓度V₄C₃微针导致细胞活力下降，而V₄C₃-Ine微针组表现出微不足道的细胞毒性，这归因于V₄C₃与Ine纳米片复合后稳定性增强，减少了降解产生的毒性。活/死细胞染色显示明显的绿色荧光，确认了V₄C₃-Ine微针优异的生物相容性；红细胞共孵育实验未引起明显溶血。划痕实验中，外源H₂O₂显著抑制细胞迁移，而V₄C3-Ine微针处理后有效缓解了这种氧化应激诱导的迁移抑制，恢复细胞迁移能力，加速划痕创面愈合，凸显其强效的ROS清除能力。DCFH-DA法检测细胞内ROS消除显示，与H₂O₂组相比，V₄C₃-Ine微针组绿色荧光强度显著降低，伴随红色荧光强度明显增加，提示其可稳定线粒体膜电位，保护细胞免受氧化应激损伤。qRT-PCR结果显示V₄C₃-Ine微针显著抑制RAW264.7细胞中主要促炎细胞因子的产生。流式细胞术评估巨噬细胞极化状态显示，V₄C₃-Ine微针有效促进巨噬细胞M2极化，有利于减少炎症并促进组织修复。

**V₄C₃-Ine微针的体外抗菌活性测试**

以MRSA为主要病原体评估抗菌和抗生物膜活性。标准菌落计数和活/死荧光图像显示PVA微针抗菌活性可忽略，V₄C₃微针、Ine微针和V₄C₃-Ine微针表现出可测量的抗菌效果；激光照射后，V₄C₃微针+激光组和V₄C₃-Ine微针+激光组细菌死亡率显著增加。重要的是，在联合抗菌治疗下，其抗菌性能超越单独氧化抗菌治疗或光动力治疗。三维活/死荧光和结晶紫染色验证抗生物膜活性结果显示，对照组、PVA微针组和Ine微针组生物膜保持完整存活，而V₄C₃微针+激光组和V₄C₃-Ine微针+激光组破坏了紧密的生物膜结构，观察到更多死细菌，其中V₄C₃-Ine微针+激光组抗生物膜活性最佳。溶血素作为抗菌活性的代表性指标，定性及定量评估显示V₄C₃-Ine微针+激光组MRSA溶血素分泌受到显著抑制。SEM成像显示对照组和PVA微针组MRSA表面相对光滑、膜结构完整，而激光处理后三组出现皱缩膜结构，确认MRSA受损或死亡。V₄C₃-Ine微针+激光组死菌数量最多且ROS水平最高，进一步验证了增强的光动力治疗效力。对铜绿假单胞菌的实验结果与MRSA一致，证明该系统的高效广谱抗菌性能。机制剖析实验通过选择性抑制光热或光动力效应，发现单独PDT组细菌存活率为62.4%，单独PTT组为74.9%，而PDT+PTT联合组最低为7.5%，证实PDT贡献大于PTT，两者具有协同抗菌效应。

**V₄C₃-Ine微针体内治疗效果评估**

建立小鼠MRSA生物膜感染皮肤创面模型，设置PBS、PVA微针、V₄C₃微针、Ine微针和V₄C₃-Ine微针五组，均接受激光照射。代表性创面照片、定量创面面积测量和细菌存活率检测一致表明，V₄C₃-Ine微针组较其他组实现更快的创面闭合和更显著的抗菌效果。第7天DHE染色显示V₄C₃-Ine微针组红色荧光强度显著低于其他各组，表明杀菌后愈合阶段ROS水平被有效抑制。流式细胞术分析显示，第3天（抗菌期）V₄C₃-Ine微针组含最高比例的M1巨噬细胞，而第7天（抗炎期）该组表现出最大群的M2巨噬细胞，这种动态转变清楚证明其兼具双重抗菌和抗炎功能。

H&E染色显示V₄C₃-Ine微针组表皮显著增厚、炎性细胞浸润减少；Masson三色染色进一步证实其诱导最突出的胶原纤维沉积；CD31免疫组化显示该组创面最致密的微血管网络，表明修复过程中血管生成显著促进；TNF-α免疫组化显示该组棕色信号最弱，证明促炎细胞因子表达显著降低。第3天组织学分析结果与第7天总体一致，比较显示V₄C₃-Ine微针组后期炎症因子水平更低，伴随更大胶原沉积和增强的新生血管形成。主要脏器的组织学检查和血液生化分析未发现明显血液学毒性或病理异常，证实优异的生物相容性和极低系统毒性。

研究结论部分指出，针对创面愈合抗菌期和抗炎期对ROS的矛盾需求，研究人员构建了基于双功能V₄C₃的智能微针治疗平台。通过利用关键组分的固有性质，该平台在NIR光照射开关下实现了双向ROS调控，克服了传统多组分系统存在的调控模式复杂、稳定性不足及诱导抗菌耐药性等固有限制。V₄C₃-Ine异质结构充分利用V₄C₃的双功能性：NIR光照下高效产生ROS以发挥强效抗菌作用，照射停止后清除过量ROS以抑制炎症反应。Ine的加入通过消耗ROS生成杀菌性HIO和I₂进一步增效；PVA水凝胶微针作为理想递送系统，实现精准治疗剂释放和对不规则创面表面的优异适应性。体外和体内实验一致证实，V₄C₃-Ine微针不仅表现广谱抗菌活性和高效生物膜清除能力，还能调节炎症反应、促进胶原沉积、加速血管生成，最终显著增强创面愈合。更重要的是，该平台展示优异的生物相容性和系统安全性，为潜在临床转化奠定坚实基础。该研究提出了一种基于双功能碳化钒的新型双向ROS调控治疗策略，凸显其在推进创面愈合治疗方面的巨大应用潜力。