《Talanta》：Signal-Amplified Cell-Free Biosensing of Antibiotics Using Tandem Fluorescent Aptamers
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Rongxin Cui|Baoyue Zhang|Zhiyuan Chang|Meilun Wang|Shengyu Yuan|Xingshuo Wang|Zeyou Chen中国天津300350，南开大学环境科学与工程学院，教育部污染过程与环境标准重点实验室摘要：基于转录因子的
Rongxin Cui|Baoyue Zhang|Zhiyuan Chang|Meilun Wang|Shengyu Yuan|Xingshuo Wang|Zeyou Chen
中国天津300350，南开大学环境科学与工程学院，教育部污染过程与环境标准重点实验室
摘要：
基于转录因子的无细胞生物传感器在快速、便携的抗生素检测方面具有很大优势，但其性能往往受限于较低的灵敏度和高背景信号。在此，我们利用RNA荧光适配体开发了改进型无细胞生物传感器，并将Pepper–HBC620系统作为低背景、高信噪比的报告基因，与常用的Broccoli适配体进行比较。为克服固有的灵敏度限制，我们采用了两种互补策略。首先，在保持摩尔比不变的情况下同时降低DNA模板和转录因子的浓度，从而有效降低了红霉素和四环素的激活阈值。其次，设计了串联荧光适配体模块（4×Broccoli和8×Pepper）作为无需酶的信号放大器。RNA二级结构预测和体外转录实验表明，这些串联结构能够保持正确的折叠方式，且荧光强度与适配体拷贝数成正比，同时不会改变激发或发射波长。通过整合这些策略，即使使用较少的DNA模板和调控蛋白，也能获得较强的荧光信号。经过优化的mphO–4×Broccoli生物传感器对红霉素的检测限可达0.1 μM，而tetO–8×Pepper系统则可将四环素的检测限降至0.05 μM，且响应时间更短。总体而言，本研究建立了基于串联RNA适配体的无细胞生物传感器，可用于高效检测抗生素。
引言
抗生素的广泛使用导致大量这类化合物被排放到水环境和土壤中[1]，它们在这些环境中逐渐积累，达到较高浓度。这类残留抗生素会改变环境微生物群落的结构[2]，诱发抗生素耐药性的产生[3]、[4]，还会通过饮用水和食物链进入人体[5]，从而对全球公共卫生安全构成严重威胁。因此，开发快速、准确的现场检测方法，用于监测抗生素污染，是保护人类健康和生态系统的关键前提。
传统的抗生素检测技术——色谱-质谱法通常需要专门的仪器和受过专业培训的人员[6]，因此不太适合在野外使用。基于合成生物学的无细胞生物传感器作为一种有前景的检测策略，通过将目标特异性识别与信号生成相结合，实现了快速、便携且可在野外使用的检测功能，适用于医疗保健和环境监测领域[6]、[7]。转录因子是無细胞生物传感器中最常用的识别元件之一。Jung等人开发了ROSALIND无细胞传感平台，该平台利用对四环素敏感的转录因子TetR、OtrR和CtcS，以及对大环内酯类敏感的MphR，能够检测废水中的四环素和大环内酯类物质。此后，该平台又被扩展用于检测多种水污染物，包括小分子和重金属[6]。在信号生成方面，人们使用了多种报告基因模块，包括RNA荧光适配体[6]、荧光素-淬灭剂对[8]、萤光素酶[9]以及绿色荧光蛋白[10]（见表1）。在此基础上，我们最近开发了冻干型无细胞生物传感器，该传感器结合了三向连接二聚体Broccoli（3WJdB）RNA适配体与TetR和MphR，用于检测水环境中的四环素和大环内酯类物质（见表1）[11]。尽管这类传感器具有便携性和操作简便性，但其检测限仍高于环境水样中常见的抗生素浓度[12]。因此，提高传感器的灵敏度对于实际的环境监测至关重要，也是本研究的核心目标。
先前的研究表明，降低转录因子的浓度可以提高无细胞生物传感器的灵敏度[7]、[13]、[14]，但往往会导致转录抑制作用减弱，从而使背景信号增加[6]、[15]。为解决这一矛盾，我们试图通过同时降低转录因子和DNA模板浓度，并引入信号放大模块，来在保持低背景信号的同时提升灵敏度。现有的信号放大策略包括链置换扩增法（SDA）[16]、等温扩增反应如环介导等温扩增法（LAMP）和核酸序列依赖性扩增法（NASBA）[17]，以及正反馈基因电路[18]、[19]，这些方法通常需要额外的酶或调控组件，会增加系统的复杂性和成本。在这里，我们采用串联荧光RNA适配体作为一种简单、无需酶的放大策略。通过在单个转录本中串联多个适配体单元，串联阵列可以提供多个荧光素结合位点，从而使同一转录事件产生更强的荧光信号。此外，由于常用的3WJdB Broccoli适配体具有相对较高的背景荧光，我们采用了最新开发的Pepper适配体[20]、[21]，它具有较低的背景信号和更高的信噪比。综合这些策略，为我们提供了一种简单的方法，用于提高无细胞生物传感器检测抗生素的灵敏度。
章节节选
转录因子和DNA模板的制备
在本研究中，我们分别使用转录因子TetR和MphR构建无细胞生物传感器，用于检测四环素和红霉素。关于转录因子表达质粒的构建方法，以及His标签化TetR和MphR蛋白的诱导、表达和纯化流程，详见补充信息部分。所设计的DNA模板序列（见补充表S1）由Sangon公司合成
Broccoli和Pepper适配体的体外荧光激活
为了评估用于无细胞传感的报告基因模块，我们选择了RNA荧光适配体Broccoli [22]和Pepper[20]作为荧光报告基因（见图S1A）。纯化的Broccoli能特异性结合DFHBI-1T（10 μM），并产生绿色荧光，其激发光和发射光的最大波长分别为472纳米和507纳米（见图S1B）。而Pepper则能结合HBC620（10 μM），产生红色荧光，其激发光波长为575纳米，发射光波长为620纳米（见图S1B）。这两种适配体均能发出荧光
CRediT作者贡献声明
Zeyou Chen：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源提供、资金获取、概念构思。Xingshuo Wang：撰写——审阅与编辑、验证、方法学。Shengyu Yuan：撰写——审阅与编辑、可视化、验证。Meilun Wang：可视化、验证、方法学。Zhiyuan Chang：可视化、方法学、研究分析、正式分析。Baoyue Zhang：验证、方法学、正式分析。Rongxin Cui：撰写——审阅与编辑、原始文章撰写
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到了中国国家自然科学基金（编号：42277386）和天津市自然科学基金（编号：24JCYBJC01900）的资助。
