利用体外三维人类类器官模型研究血脑屏障处的神经免疫相互作用：炎症与缺血-再灌注损伤

《Cells》：Modeling Neuroimmunological Interactions at the Blood–Brain Barrier Using In Vitro 3D Human Organoids: Inflammation and Ischemia–Reperfusion Injury

　　

众多中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）病理状态均涉及血脑屏障（Blood–Brain Barrier, BBB）的破坏以及免疫细胞向脑内的迁移。控制免疫细胞跨血脑屏障迁移代表了一种潜在的治疗靶点。本研究描述了一种由六种主要脑细胞类型组成的3D人类血脑屏障球体模型（3D human BBB spheroidal model）的应用，以检测正常及病理条件下——包括炎症和缺血-再灌注损伤（Ischemia–Reperfusion Injury, IRI）——的免疫细胞跨内皮迁移（Transendothelial Migration, TEM）。血脑屏障类器官中的细胞类型包括位于球体表面的脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells, HBMVECs）和周细胞，以及由星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和神经祖细胞组成的核心。该模型重现了CD4⁺ T细胞及免疫调节因子与血脑屏障处HBMVECs的相互作用，包括其表面表达细胞黏附分子的变化。本研究表明，该人类3D血脑屏障模型能够重现正常及炎症、缺氧-再灌注损伤病理条件下血脑屏障的诸多特征。促炎细胞因子和缺氧会破坏血脑屏障并增加其通透性，降低紧密连接（Tight Junctions, TJs）的表达。促炎细胞因子和再灌注会增加细胞黏附分子的表达并促进免疫细胞跨内皮迁移。免疫细胞跨内皮迁移可被抗细胞黏附分子抗体降低，进一步验证了该模型在研究神经免疫相互作用以及进行高通量筛选调节免疫细胞向脑内迁移的治疗靶点方面的价值。

## 研究背景与问题提出

血脑屏障是维持中枢神经系统稳态的关键结构，由脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells, BMVECs）及其与周细胞、星形胶质细胞等形成的神经血管单元（Neurovascular Unit, NVU）共同构成。多种神经系统疾病如多发性硬化、视神经脊髓炎谱系疾病、阿尔茨海默病、癫痫及缺血性卒中后复灌注损伤等均存在不同程度的血脑屏障破坏，导致免疫细胞浸润脑组织。细胞黏附分子如细胞间黏附分子1（Intercellular Adhesion Molecule 1, ICAM1)和血管细胞黏附分子1（Vascular Cell Adhesion Molecule 1, VCAM1）在免疫细胞与BMVECs的相互作用中发挥关键介导作用。然而，现有体外研究多依赖于transwell血脑屏障模型，且常使用非人源细胞的BMVECs单培养体系，难以精确模拟人体生理反应，这也是药物转化失败的重要原因之一。因此，构建能够重现人类血脑屏障复杂性的三维生理学模型，对于推进神经免疫相互作用的基础研究及治疗靶点筛选具有迫切需求。

## 研究目的与方法概述

研究人员旨在验证其建立的3D人类血脑屏障类器官模型在模拟正常及炎症条件下神经免疫相互作用的可行性，并探索该模型作为抗细胞黏附分子治疗筛选平台的应用潜力。研究中采用的主要关键技术方法包括：（1）自组装3D血脑屏障类器官培养技术（含HBMVECs、周细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞和神经祖细胞六种人脑细胞类型）；（2）炎症模型——促炎细胞因子（TNF-α和IFN-γ，10 ng/mL，24 h）处理；（3）缺血-再灌注损伤模型——氧糖剥夺-再氧合（Oxygen-Glucose Deprivation-Reoxygenation, OGD-R，12 h缺氧/0.1% O₂，随后24-72 h再灌注）；（4）血脑屏障完整性评估——70 kDa异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通透性检测；（5）缺氧与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）检测——Image-iT Green Hypoxia Reagent和CellROX Deep Red荧光探针；（6）分子表达分析——TaqMan qPCR及ELISA检测紧密连接蛋白（occludin、claudin-12、ZO-1、claudin-5）和细胞黏附分子（VCAM1、ICAM1、PECAM1）；（7）免疫功能检测——从健康供体外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中分离初始CD4⁺ T细胞，经CD3/CD28激活后标记PKH26染料，通过激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析其跨血脑屏障迁移情况；（8）功能阻断实验——使用抗VCAM1、抗ICAM1和抗PECAM1抗体（20 μg/mL）预处理类器官。

## 研究结果

**细胞死亡与ATP产生检测：** 通过钙黄绿素（Calcein AM）和溴化乙啡啶（Ethidium Homodimer-1）活/死细胞染色评估，TNF-α和IFN-γ处理24 h均显著诱导类器官细胞死亡（p=0.007和p=0.008）。OGD-R模型中，12 h缺氧及24-72 h再灌注均导致显著细胞死亡（p<0.0001, p=0.012, p=0.029, p=0.0003）。ATP检测显示，缺氧12 h及再灌注24 h、48 h后ATP产生显著降低（p=0.0002, p<0.0001, p=0.002），72 h再灌注时有所恢复。

**缺氧与ROS诱导验证：** Image-iT Green探针显示缺氧组绿色荧光强度显著高于常氧对照（p<0.0001）；HIF-1α mRNA表达在缺氧后显著上调（p=0.046）。CellROX检测表明ROS在缺氧后显著增加（p<0.0001），再灌注期间虽有所下降但仍高于基线（24 h: p=0.01; 48 h: p=0.001; 72 h: p=0.02）。MMP-9 mRNA在缺氧（p=0.0003）、再灌注24 h（p=0.016）和72 h（p=0.025）时降低，48 h再灌注呈升高趋势但不显著。

**血脑屏障通透性改变：** 70 kDa葡聚糖通透性检测显示，TNF-α和IFN-γ处理后通透性显著增加（均p<0.01）。OGD-R模型中，缺氧（p=0.0007）及24 h（p=0.003）、48 h（p=0.006）、72 h（p=0.001）再灌注后通透性均显著升高。TNF-α分泌在缺氧（p=0.008）及各再灌注时间点（24 h: p=0.006; 48 h: p=0.015; 72 h: p=0.003）均显著升高。

**紧密连接表达变化：** 细胞因子处理后，occludin mRNA（TNF-α: p<0.0001; IFN-γ: p<0.0001）和claudin-12 mRNA（TNF-α: p<0.0001; IFN-γ: p=0.0004）均显著下调；IFN-γ显著降低occludin蛋白（p=0.037），TNF-α显著降低claudin-12蛋白（p=0.03）。OGD-R模型中，ZO-1在再灌注48 h显著升高（p=0.002）、72 h显著降低（p=0.026）；occludin在缺氧时降低（p=0.0002）、48 h再灌注升高（p=0.033）；claudin-5仅在72 h再灌注时显著降低（p=0.026）。

**细胞黏附分子表达变化：** TNF-α和IFN-γ均显著上调VCAM1 mRNA（p=0.0012, p=0.0007）和ICAM1 mRNA（p<0.0001, p<0.0001），蛋白水平有升高趋势但无统计学显著性。OGD-R模型中，VCAM1（p=0.004）和ICAM1（p=0.013）在再灌注48 h显著上调；PECAM1在再灌注72 h显著下调（p=0.038）。

**CD4⁺ T细胞跨内皮迁移及抗体阻断：** 细胞因子处理后，T细胞迁移显著增加（TNF-α: 共聚焦p=0.0002, 流式p=0.02；IFN-γ: 共聚焦p=0.0005, 流式p=0.012）。抗VCAM1、抗ICAM1和抗PECAM1抗体在IFN-γ处理组均显著减少T细胞迁移（共聚焦：p=0.0007, p<0.002, p=0.004；流式：p=0.011, p=0.03, p=0.013）；在TNF-α处理组及未处理组也观察到类似阻断效果。OGD条件下T细胞迁移反而降低（共聚焦p=0.0009, 流式p=0.0008），抗ICAM1抗体在此条件下无显著阻断作用；但再灌注48 h后T细胞迁移显著增加（共聚焦p=0.025, 流式p=0.0007），抗ICAM1抗体可有效阻断（共聚焦p=0.001, 流式p=0.002）。

## 讨论与结论

研究人员指出，免疫失调参与多种脑部疾病的病理生理过程。现有二维细胞培养或transwell模型无法重现神经血管单元的细胞复杂性，而非人源细胞的使用也不能精确模拟人类反应。该3D血脑屏障类器官模型包含全部六种主要人类脑细胞类型，且细胞比例基于人脑不同区域平均比例，所有细胞均为人类来源并直接接触，在结构和功能方面与天然神经血管单元高度相似。

关于模型验证，促炎细胞因子剂量选择基于既往研究确定的最小有效浓度。OGD-R模型成功诱导了缺氧状态，表现为HIF-1α上调、ATP产生下降及ROS持续生成。细胞死亡在缺氧及再灌注期间均有增加，可能与能量衰竭、细胞因子释放及HIF-1α诱导的凋亡途径有关。TNF-α分泌在再灌注72 h达峰值，与临床卒中后变化规律一致。MMP-9在48 h再灌注时呈现升高趋势，提示可能存在其他脑细胞如星形胶质细胞和小胶质细胞的贡献。

通透性增加与紧密连接蛋白表达变化相关，但IFN-γ对occludin的影响存在文献争议，提示不同模型和细胞来源可能导致差异结果。细胞黏附分子在炎症和再灌注后的上调与免疫细胞跨内皮迁移增加相符，抗细胞黏附分子抗体的成功阻断验证了该模型的功能完整性。值得注意的是，OGD期间T细胞迁移降低且抗ICAM1无效，可能与缺氧期间细胞机械关闭、黏附分子下调或替代迁移通路激活有关；而再灌注48 h后迁移增加对抗ICAM1敏感，与临床再灌注损伤时程相符。

该研究发表于《Cells》杂志，其重要意义在于首次报道了利用体外3D球状脑模型检测免疫细胞通过血脑屏障的浸润。该模型为该研究团队此前建立的3D血脑屏障模型的进一步应用拓展，为神经免疫相互作用研究提供了具有人类特异性的生理学相关平台，能够 bridging 简单二维模型与昂贵体内动物模型之间的鸿沟，实现抗细胞黏附分子疗法的高通量筛选，加速药物向临床实践的转化。

研究结论指出：研究神经免疫相互作用日益重要，越来越多的证据表明免疫系统参与此前认为仅具退行性特征的神经系统疾病甚至精神疾病。现有血脑屏障transwell模型多为非人源脑内皮单层或仅与周细胞、星形胶质细胞的共培养，而该3D血脑屏障模型包含六种主要人类脑细胞类型，比例与人脑相似，在关键结构和功能方面类似天然神经血管单元。进一步表征屏障表面分子的表达与功能，以及神经血管单元各元素与BMVECs之间的连接和串扰，将增强该模型的应用价值。研究不同免疫细胞亚群的跨内皮迁移及参与此过程的细胞黏附分子，将有助于探索其他黏附分子的治疗潜力。