毒死蜱(Chlorpyrifos, CPF)与全氟己烷磺酸(Perfluorohexanesulfonic acid, PFHxS)单一及联合暴露对发育期斑马鱼(Danio rerio)神经行为学及分子水平改变的影响

《Toxics》：Neurobehavioral and Molecular Alterations Following Single and Combined Exposure to Chlorpyrifos and PFHxS in Developing Zebrafish (Danio rerio)

　　

全氟己烷磺酸(PFHxS)是全氟和多氟烷基物质(PFAS)的一种，常在水生环境中被检出；毒死蜱(CPF)是广泛使用的有机磷杀虫剂。尽管二者单独毒性已有较多描述，但其联合效应仍不清楚。本研究评估了CPF(0.7~700 μg/L)单独及与PFHxS(10 μg/L)联合暴露对斑马鱼胚胎的影响。暴露5 d后检测存活率、孵化率、畸形率、运动活性、氧化应激、凋亡及相关基因表达。CPF呈浓度依赖性降低存活率，联合暴露时存活率略有进一步下降，而孵化率未受影响。畸形率随CPF浓度升高而增加，PFHxS共暴露时趋势一致，提示毒性主要由CPF介导。运动活性总体呈浓度及光暗周期依赖性的降低。活性氧(ROS)水平与凋亡率未见显著变化。基因表达分析显示神经毒性相关标志物(ache、gfap、shha、syn2a)上调，尤以中等浓度CPF及联合暴露组明显。氧化应激相关基因呈差异响应，联合处理组中sod1上调而cat下调。综上，与CPF单独暴露相比，联合暴露未显著增强毒性，CPF是观察到效应的主要贡献者，PFHxS影响有限。

论文解读：毒死蜱(CPF)与全氟己烷磺酸(PFHxS)单一及联合暴露对发育期斑马鱼神经行为及分子水平改变的影响

该研究发表于《Toxics》。全氟和多氟烷基物质(PFAS)因C–F键强稳定性而在环境中持久残留，其中短链PFHxS常被作为PFOS替代品广泛使用且于全球水体、土壤及生物体内被检出，具发育毒性、神经毒性及氧化应激诱导潜能。有机磷杀虫剂毒死蜱(CPF)亦频发于农业区地表水，可致鱼类存活率下降、畸形、行为异常及乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制。目前CPF与PFHxS共存于受污染水体，但二者联合毒性及相互作用机制尚不清楚。鉴于行为学是CPF共暴露最敏感终点之一，研究人员假设CPF与PFHxS联合暴露会改变单一暴露毒性谱，遂以发育期斑马鱼为模型，综合评估发育、行为及分子端点，为农药–PFAS混合污染物早期生命阶段风险评估提供数据。

主要关键技术方法

研究人员选用AB×Tübingen品系斑马鱼(Danio rerio)受精后约6 hpf正常胚胎，随机分为ERM空白对照、0.1% DMSO溶剂对照、CPF单独(0.7、7、70、700 μg/L)、PFHxS单独(10 μg/L)及CPF/PFHxS混合(固定PFHxS 10 μg/L＋四梯度CPF)组，n=5生物学重复/组(每皿20枚胚胎)，27±1 ℃持续暴露并每日换液。主要检测技术包括：体视镜下逐日记录存活率、孵化率及畸形类型；第5 dpf经吖啶橙(AO)染色─荧光成像定量凋亡；第5 dpf匀浆–H₂-DCFDA荧光法测细胞内ROS；第5 dpf取幼虫进行视觉运动反应(VMR)光暗交替测试──DanioVision系统红外追踪总移动距离并相对溶剂对照归一化；TRIzol抽提总RNA→去除gDNA→反转录cDNA→实时荧光定量PCR(qPCR)检测神经毒性相关基因(ache、gfap、shha、syn2a、atp7a、elavl3、mbp、nestin、α1-tubulin)与氧化应激相关基因(sod1、cat、hsp70)，以rps18、β-actin、rpl13α为内参；数据Shapiro–Wilk检验正态性后log₁₀转换，单因素ANOVA＋Dunnett's多重比较 vs 溶剂对照(p<0.05为显著)。

研究结果

3.1. Survival, Hatching Rate, and Morphological Deformities（存活率、孵化率与形态畸形）

通过5 d逐日观察及统计发现：CPF单独700 μg/L组第5 dpf存活率约25%，CPF/PFHxS混合700/10 μg/L组降至约5%，提示高剂量下PFHxS轻微加剧CPF致死效应；低剂量0.7 μg/L CPF单独显著降低存活率而混合组未现此效。孵化率各组间无差异。畸形以脊柱后凸(lordosis)、心包水肿、卵黄囊水肿为主，CPF单独70及700 μg/L显著升畸形率，混合组仅700 μg/L CPF＋PFHxS显著，表明畸形主要由CPF驱动，PFHxS未明显加重。

3.2. Visual Motor Response（视觉运动反应/VMR）

第5 dpf VMR光暗交替测试中，部分浓度CPF单独或CPF/PFHxS混合使幼虫总移动距离降低(低活动度/ hypoactivity)，如首暗期CPF 7 μg/L＋PFHxS组合、首亮期CPF 70 μg/L单独及混合组；次暗期PFHxS单独及CPF 7 μg/L单独或混合也致低活动度。例外为第三暗期CPF 7 μg/L单独出现活动增加(hyperactivity)。表明行为是最敏感亚致死终点，CPF主导运动抑制，PFHxS可微调该效应。

3.3. Reactive Oxygen Species（活性氧水平）

第5 dpf幼虫匀浆DCF荧光法定量胞内ROS，各浓度CPF单独、PFHxS单独及混合组与溶剂对照相比均无显著差异(p=0.24)，提示在本实验条件下未引起整体ROS累积。

3.4. Acridine Orange Staining/Apoptosis Assay（吖啶橙染色/凋亡检测）

AO染色荧光强度定量显示，各处理组与溶剂对照相比凋亡信号无显著增加(p=0.24)，与上述ROS结果呼应，提示抗氧化防御可能阻止了明显细胞凋亡。

3.5. Gene Expression Analysis（基因表达分析）

神经毒性相关基因中，ache在CPF 0.7及70 μg/L＋PFHxS混合组上调；gfap在CPF 70 μg/L单独上调；shha在CPF 70 μg/L＋PFHxS混合组上调；syn2a在CPF 70 μg/L单独及混合组均上调；其余神经元标志基因(atp7a、elavl3、mbp、nestin、α1-tubulin)无显著变化。氧化应激相关基因中，sod1在CPF 0.7及700 μg/L单独及混合组上调；cat在CPF 700 μg/L＋PFHxS混合组下调；hsp70无差异。表明CPF及联合暴露可扰动神经发育相关转录本及抗氧化酶转录本，但未超出蛋白水平ROS稳态调控能力。

讨论与结论总结

讨论指出CPF经典毒理为AChE抑制及神经发育干扰，PFHxS可通过核受体结合与氧化应激起作用；二者可能因电荷互补致弱物理化学互作降低生物可利用度，加之作用机制不同，未呈现明显协同或拮抗，多为CPF主导毒性，PFHxS轻微调制(尤在高浓度致死及部分基因/行为端点)。行为改变较传统发育指标更敏感。sod1上调伴cat下调但ROS未变，提示早期代偿性抗氧化转录可维持氧化还原稳态。作者承认未测抗氧化酶活性及脂质过氧化属局限。

结论部分翻译如下：

综上所述，CPF单独及与PFHxS联合暴露均可诱导斑马鱼死亡率与发育畸形，但基于上述终点PFHxS对CPF毒性贡献有限。运动活性在低至CPF 0.7 μg/L＋PFHxS 10 μg/L即被抑制，符合CPF已知神经毒性，并得到神经毒性相关基因(ache、shha、syn2a等)表达改变的支持，该基因变化在相同低浓度联合组亦可检出。氧化应激相关基因呈差异表达但ROS水平未变，提示抗氧化响应足以维持测试条件下的氧化还原稳态。结果表明CPF是所观察毒性的主要驱动因子，PFHxS仅起较小调节作用。未来应在环境相关浓度下探究CPF与PFHxS共暴露对斑马鱼发育、氧化应激及行为的长期效应，并拓展生化端点以阐明潜在毒性机制。