《Analytica Chimica Acta》：A Robust HPLC-HILIC Enrichment System for O-Glycoproteomics Profiling of Plasma and Cerebrospinal Fluid Across Alzheimer's Disease Progression
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邓振鹏|王燕|刘磊|郭欣|朱海阳|董明明|葛玉松|余永亮|叶明亮中国辽宁省沈阳市110819，东北大学理学院化学系分析科学研究中心，邮编332摘要背景阿尔茨海默病（AD）的发病机制涉及脑组织及外周生物流体中的广泛分子变化，但由于全面分析O-糖蛋白组的技术限制，蛋白质O-连接糖基化
邓振鹏|王燕|刘磊|郭欣|朱海阳|董明明|葛玉松|余永亮|叶明亮
中国辽宁省沈阳市110819，东北大学理学院化学系分析科学研究中心，邮编332
摘要
背景
阿尔茨海默病（AD）的发病机制涉及脑组织及外周生物流体中的广泛分子变化，但由于全面分析O-糖蛋白组的技术限制，蛋白质O-连接糖基化在疾病进展中的作用至今仍不明确。
结果
为填补这一空白，我们开发了一种高效的高性能液相色谱-亲水相互作用色谱（HPLC-HILIC）系统，该系统可有效富集来自复杂生物样本蛋白消化物中的完整O-糖肽。该系统被用于分析不同AD进展阶段血浆样本以及AD患者脑脊液（CSF）中的O-糖蛋白组。研究发现，在血浆中，随着疾病进展，岩藻糖基化糖肽水平下降，而唾液酸基化糖肽水平上升。相比之下，CSF样本中的O-糖肽数量增加，且唾液酸化程度也更高。此外，当血脑屏障受损时，对AD患者CSF和血浆中的O-糖基化模式进行分析发现，血浆中ITIH4（Q14624）和SERPINA5（P05154）的O-糖基化程度增加，而CSF中APOE（P02649）的唾液酸基化O-糖基化程度升高。这些观察结果表明，唾液酸基化O-糖基化可能在AD的病理过程中起着关键作用。
意义
总体而言，我们建立了一套完善的O-糖蛋白组学分析流程，用于研究AD患者CSF与血浆中的O-糖基化模式。这些结果为了解O-糖基化在AD进展中的作用提供了重要见解，同时也凸显了该分析平台在研究AD及其他神经退行性疾病中O-糖基化动态变化方面的应用潜力。
章节节选
引言
翻译后修饰（PTMs）在调节蛋白质结构[1]、[2]、[3]、蛋白质组装[4]、细胞定位[5]以及生物功能[6]、[7]方面发挥着重要作用。糖基化是最为常见且多样的PTM形式之一，而蛋白质O-糖基化在真核生物中普遍存在[8]。蛋白质O-糖基化主要包括黏蛋白型O-连接N-乙酰半乳糖胺化（O-GalNAcylation）和O-连接N-乙酰葡萄糖胺化（O-GlcNAcylation）[9]。
化学品与试剂
乙腈（ACN，HPLC级）由德国达姆施塔特的Merck公司提供。碳酸氢铵（NH4HCO3）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA，HPLC级）、尿素以及胰蛋白酶（牛源，经TPCK处理）均购自美国密苏里州的Sigma公司。PNGase F则从美国马萨诸塞州伊普斯威奇的New England Biolabs公司购买。所有实验中使用的高纯度水均通过Milli-Q系统（Millipore公司，马萨诸塞州米尔福德）进行净化。其他所有化学品和试剂的质量均达到或高于分析级标准。
优化HILIC-Amide柱用于富集完整O-GalNAc糖肽的条件
为减少大量非糖肽的干扰，富集步骤对于提高完整糖肽检测的灵敏度至关重要[40]。近年来，HILIC-Amide HPLC柱已被用于富集N-端完整的糖肽，并显示出良好的效果[41]。因此，我们进一步研究了HILIC-Amide柱是否也可用于富集O-糖肽。为解决这一问题，我们建立了一套高效的HILIC分析流程，用于富集O-GalNAc糖肽（见图1a）。
结论
总之，我们建立了一套高效且可靠的O-糖蛋白组学分析流程，用于研究AD患者CSF与血浆中的O-糖基化模式。该流程采用HPLC-HILIC技术进行糖肽富集，通过优化富集条件，能够有效捕获具有不同组成类型的O-连接糖肽。随后，我们对AD患者及轻度认知障碍患者血浆样本中的O-糖基化变化进行了分析。定量O-糖蛋白组学分析结果显示出明显的差异。
CRediT作者贡献说明
叶明亮：指导、方法设计、资金获取、概念构思。葛玉松：资源提供、概念构思。余永亮：指导、方法设计、资金获取、概念构思。朱海阳：正式分析。董明明：方法设计、正式分析。刘磊：正式分析。郭欣：正式分析。王燕：方法设计、正式分析。邓振鹏：初稿撰写、方法设计、正式分析、概念构思
利益冲突声明
作者声明没有已知的经济利益冲突或可能影响本文研究结果的个人关系。
数据可用性
所有原始数据及搜索结果均已上传至JPOST数据库。其中JPOST的访问号为JPST004554，Proteome Xchange的访问号为PXD077304。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知经济利益冲突或个人关系。
致谢
本研究部分得到了以下机构的资助：中国国家重点研发计划（项目编号：2024YFA1306300和2022YFC3400800）、中国国家自然科学基金（项目编号：22034007、22274014），以及中国科学院大连化学物理研究所和中国科学院联合基金会与大连医科大学第二医院（项目编号：DMU-2&DICP UN202404）。
