《Current Research in Food Science》：Lactobacilli, best allies of mental health: a probiogenomic approach to identify potential psychobiotic strains
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靶向膳食策略和补充剂是治疗认知问题的一种有前景的方法。多组学(Multi-omic)方法可加速新型精神益生菌(Psychobiotic)菌株的发现及其应用。研究人员应用宏基因组学(Metagenomics)和比较基因组学(Comparative genomic
靶向膳食策略和补充剂是治疗认知问题的一种有前景的方法。多组学(Multi-omic)方法可加速新型精神益生菌(Psychobiotic)菌株的发现及其应用。研究人员应用宏基因组学(Metagenomics)和比较基因组学(Comparative genomics)指导从发酵食品中分离和筛选新型精神益生菌菌株。研究人员筛选了1185份发酵食品的宏基因组，揭示了编码神经活性分子生物合成基因的存在，并据此分离出73株新型乳酸菌(Lactic Acid Bacteria, LAB)。比较基因组分析突显了种属特异性模式，鉴定出短乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)和发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)为潜在精神益生菌。针对神经活性代谢物产生的体外功能筛选确认了4株最具前景的候选菌株——植物乳杆菌(Lactiplantobacillus plantarum) TUCC00000144、发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum) TUCC00000777、短乳杆菌(Levilactobacillus brevis) TO10及食二酸 lentilactobacillus diolivorans B92，可用于开发旨在支持心理健康的膳食补充剂或创新发酵食品。
研究背景与目的
肠道微生物组通过微生物-肠-脑轴(Microbiota-Gut-Brain Axis)参与宿主生理及心理健康调节，发酵食品来源的乳酸菌可作为潜在精神益生菌(Psychobiotic，指对心理和神经终点产生积极影响的特定益生菌株)。然而传统益生菌验证缺乏标准化且耗时，菌株功能具株水平特异性且机制复杂。为克服传统表型筛选的盲目性，研究人员开展本研究，旨在通过益生菌基因组学(Probiogenomics，结合先进"组学"技术全面分析潜在益生菌株遗传潜力的策略)流程，从传统意大利发酵食品中高效筛选并鉴定具有产生神经活性化合物能力的新型精神益生菌候选株。该研究发表于《Current Research in Food Science》。
主要关键技术方法
研究人员首先构建精神益生菌活性相关基因(神经递质及神经活性分子生物合成关键酶基因)的自定义参考数据库；其次对NCBI下载的1185份发酵食品宏基因组进行质控、组装及基因预测，使用DIAMOND比对自定义库进行生物信息学(in silico)筛查；随后从70份不同类型发酵食品(含酸面团、橄榄、奶酪、发酵肉、开菲尔水等)中分离革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性乳酸菌，经MALDI-TOF初筛及全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)确证分类，并从NCBI下载3935株22个LAB物种的公开基因组进行比较基因组分析；基于基因组特征选取18株最有潜力菌株，在添加特定氨基酸前体(谷氨酸钠、酪氨酸、胆碱、色氨酸)及辅因子磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5'-phosphate, PLP)的MRS培养基中培养，采用液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS/HILIC)定量检测上清液中γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)、乙酰胆碱(Acetylcholine)、血清素(Serotonin/5-HT)及儿茶酚胺(Epinephrine, Norepinephrine, Dopamine)的生成量。
研究结果
3.1. Functional profile of various fermented foods harbor potential psychobiotic microbiome
研究人员筛查1185份发酵食品宏基因组中神经活性分子生物合成相关基因的分布，发现不同基质呈矩阵特异性聚类：成熟干酪(Ripened cheeses，如帕玛森干酪、羊乳干酪等)形成独立聚类，谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)基因扩散度高；蓝纹奶酪、新鲜及成熟奶酪、发酵谷物和发酵饮料中神经递质相关通路基因尤为丰富，证实发酵食品微生物组具备神经活性化合物生物合成潜力，可作为精神益生菌来源。
3.2. Identification of LAB Isolates: Results of MALDI-TOF and genomic confirmation (WGS)
从发酵食品中分离获得73株LAB，MALDI-TOF初鉴与WGS确证的总体分类不一致率为10.96%(种水平差异8.22%，属水平2.74%)，主要源于Weissella与Furfurilactobacillus等系统发育相近群蛋白谱重叠及乳杆菌属(Lactobacillus)重新分类(Lactiplantibacillus, Levilactobacillus等)，证实WGS是LAB准确种水平鉴定的必要手段。分离株涵盖Lactiplantibacillus plantarum、Levilactobacillus brevis、Limosilactobacillus fermentum、Lentilactobacillus diolivorans等。
3.3. Comparative genomic analysis of neuroactive-related gene distribution across fermented food-associated LAB species
对3935株LAB基因组筛查86个神经活性相关基因，发现种特异性分布模式：Lp. plantarum(99%)和Lv. brevis(96%)基因组中GAD基因检出率极高；Lactiplantibacillus、Lacticaseibacillus及Lentilactobacillus属部分菌种富含色氨酸(Tryptophan)分解代谢基因(如色氨酸合成酶检出率80%~100%)及芳香族氨基酸氨基转移酶基因；亚麻酸异构酶(Linoleate isomerase，催化亚油酸Linoleic acid, LA转化为共轭亚油酸Conjugated linoleic acid, CLA)在Lactobacillus helveticus(98%~100%)、Weissella confusa及W. paramesenteroides中高度流行；丙酸盐(Propionate)途径的延胡索酸水合酶(Fumarate hydratase)和苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase)广泛存在(93%~100%)；酪氨酸脱羧酶(Tyrosine decarboxylase)仅少量见于Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis(24%)和Latilactobacillus curvatus(36%)。未检出色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase)，但Lentilactobacillus kefiri和L. diolivorans等含色氨酸2-单加氧酶(Tryptophan 2-monooxygenase)基因。
3.4. Strain-specific pattern for psychobiotic activity
73株分离株基因组筛查显示：所有Lp. plantarum、2/3 Lp. pentosus及Lv. brevis TO10、Lm. fermentum TUCC00000777/TUCC00000776、Lentilactobacillus diolivorans A1含GAD基因；丙酸盐途径上游酶广泛存在。据此遴选18株(含Lp. plantarum多个分离株、Lv. brevis TO10、Lm. fermentum TUCC00000777/TUCC00000776、L. diolivorans A1/B92等)进入体外功能验证。
3.5. In vitro neurotransmitter production reveals functional profile of the most promising strains
18株菌体外诱导产神经活性代谢物检测显示：所有测试株均产乙酰胆碱(1.89~10.47 mg/L)；5株产GABA，其中Lv. brevis TO10产量最高(0.82 mg/L)；Lp. plantarum B1产三种儿茶酚胺(肾上腺素Epinephrine、去甲肾上腺素Norepinephrine、多巴胺Dopamine)，TUCC00000144仅产多巴胺，TUCC00000015产肾上腺素和去甲肾上腺素；任一菌株未检测到血清素(Serotonin)。综合基因组潜力与体外功能，确定Lp. plantarum TUCC00000144、Lm. fermentum TUCC00000777、Lv. brevis TO10及L. diolivorans B92为最具前景的精神益生菌候选组合。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究通过宏基因组与益生菌基因组学联用策略证实了发酵食品(尤指奶酪、发酵谷物和饮料)微生物组具神经活性化合物合成基因潜力，比较基因组揭示Lv. brevis、Lp. plantarum和Lm. fermentum相对富集神经活性相关基因。自意大利传统发酵食品中分离的73株LAB经WGS确认，其中Lp. plantarum普遍携带GAD基因。体外功能验证表明候选株可将膳食前体生物转化(非从头合成de novo)为GABA、乙酰胆碱及儿茶酚胺。最终研究人员得出结论：建立的Probiogenomics流程可有效加速精神益生菌候选株靶向筛选；Lactiplantibacillus plantarum TUCC00000144、Limosilactobacillus fermentum TUCC00000777、Levilactobacillus brevis TO10及Lentilactobacillus diolivorans B92是最具开发为针对心理健康的膳食补充剂或功能性发酵食品潜力的菌株。但基因组携带相关基因及体外产神经活性物质不代表体内必然表达，仍需体内动物实验及人体随机对照试验(Randomized Controlled Trial, RCT)进一步验证精神益生菌活性，未来需结合菌株追踪技术与标准化方案推进临床转化。
