《Forensic Science International: Genetics》：Comparison of key diagnostics for probabilistic interpretation of STR mixture data generated with length-based and MPS methodologies
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Kyle Duke|Daniela Cuenca|Kevin Cheng|Jeanette Wallin加利福尼亚州司法部法医服务局，Jan Bashinski DNA实验室，地址：美国加利福尼亚州里士满市西Cutting大道1001号，邮编94804摘要本研究直接比较了两种概率
Kyle Duke|Daniela Cuenca|Kevin Cheng|Jeanette Wallin
加利福尼亚州司法部法医服务局，Jan Bashinski DNA实验室，地址：美国加利福尼亚州里士满市西Cutting大道1001号，邮编94804
摘要
本研究直接比较了两种概率基因分型软件在处理DNA混合物时的性能：一种为STRmix? v2.8，它接受基于长度的STR输入数据；另一种为STRmix? NGS v1.1.0，它接受基于序列的STR输入数据。研究使用相同的两人、三人和四人DNA混合物，分别通过基于长度的GlobalFiler?试剂盒以及大规模并行测序技术中的ForenSeq? Signature Prep和MainstAY试剂盒生成数据，然后利用相应的概率基因分型软件对这些数据集进行解析。比较的重点是三种核心的解析指标：似然比、混合物比例和基因型权重。基于序列的似然比平均比基于长度的似然高5个数量级。研究探讨了可能导致这一差异的三个因素：检测灵敏度、等位基因检测能力以及等位基因群体频率。在分析混合物比例时，还考虑了模板浓度问题，包括使用MPS试剂盒制备样本时的珠子标准化处理。对比结果表明，STRmix? v2.8和STRmix? NGS v1.1.0在混合物解析方面的效果相当，这意味着MPS数据所具有的更高区分能力可以通过软件方法充分体现出来，且不会影响基因分型的准确性。此外，序列信息还能为专家们确定这些概率基因分型系统运行所需的基本假设提供重要帮助。总体而言，研究表明将MPS技术与概率基因分型相结合，能够有效提升STR混合物的解析能力。
引言
在法医DNA领域，人们历来对引入新技术和方法较为谨慎，尤其是在面临重大变革时。法医DNA工作涉及的重大责任，以及验证和采用新分析方法所需的时间、成本和法律风险，都使得创新进展十分缓慢。大规模并行测序技术就是这样的一个例子。随着时间的推移，MPS技术已逐渐变得更为经济实惠，也更容易被法医领域所采用，但其全面普及仍面临诸多障碍，包括成本效益问题、从业者经验不足、数据可靠性以及机构延续性等方面的挑战[1]。目前，业界仍然以毛细管电泳结合激光诱导荧光检测技术来分析通过聚合酶链反应扩增得到的短串联重复序列基因座，这一方法自20世纪90年代初以来就一直被广泛使用，相关研究也很多，例如[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。
尽管基于长度的STR分析方法在法医领域依然占据主导地位，但在过去十年中，人们还是逐步开始尝试采用MPS技术。最初，线粒体DNA测序技术率先得到了应用，例如[8]、[9]、[10]、[11]，而随着法医遗传谱系学的发展，人们对MPS技术的认知也进一步加深，不过常染色体和Y染色体STR标记的采用速度则相对较慢。目前已有几种STR测序方法经过了开发验证和进一步评估，例如[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]，但这些方法中只有少数真正得到了实际应用。为了推动这项更具区分能力的测序技术的发展，目前需要一些关键的解决方案，比如自动化试剂盒制备技术[例如18、24]、混合物分析软件[例如25]、[26]、[27]、[28]、已测序的等位基因群体频率数据[29]，以及统一的命名规范建议[30]。
对STR基因座进行测序的主要优势在于，它能够通过识别STR等位基因来获取更多信息——这些等位基因在片段分析中表现为相同长度，但实际序列却有所不同。区分不同长度的等位基因不仅对单一来源样本的分析有帮助，对DNA混合物的分析也同样重要，因为额外的等位基因信息有助于提高确定样本来源数量的能力，同时也能降低基因型判定的不确定性，从而提升分析效率。通过识别等位基因所获得的信息，再加上由于等位基因多样性增加而导致的较低等位基因频率，能够显著提高基于测序数据的混合物分析的似然比数值。
本文旨在量化序列信息对常染色体STR混合物分析的影响。具体而言，研究比较了两种概率基因分型软件在分析相同的两人、三人和四人DNA混合物时的性能，一种软件接受基于长度的毛细管电泳输入数据（STRmix? v2.8），另一种则接受基于序列的大规模并行测序输入数据（STRmix? NGS v1.1.0）。比较的重点是这两种软件输出的三种核心指标，也就是STRmix?系列软件的开发者所认定的用于混合物分析的关键指标：似然比、混合物比例和基因型权重[31]。研究中使用了两组来自MPS数据的常染色体STR分析结果，一组是通过ForenSeq? DNA Signature Prep试剂盒获得的，另一组则是通过ForenSeq? MainstAY试剂盒获得的，以此来评估不同商业测序平台之间的分析一致性，并为毛细管电泳与大规模并行测序技术的比较提供更多参考。本研究的核心目标是确定，通过STRmix? NGS v1.1.0软件对相应的MPS数据进行分析，是否也能得到与STRmix? v2.8类似质量的一致性分析结果。
内容节选
材料与方法
从14名自愿参与研究的无关人员口中采集口腔细胞DNA，这些人员均签署了知情同意书。DNA提取工作是使用PrepFiler? DNA提取试剂盒（Thermo Fisher公司，美国加利福尼亚州南旧金山）完成的，而DNA浓度的测定则按照制造商推荐的流程，使用Applied Biosystems? Quantifiler? Trio DNA定量试剂盒（同样来自Thermo Fisher公司）进行。这14名捐赠者的未降解DNA提取物（在此匿名称为捐赠者A至N）被用于后续研究
似然比比较
在STRmix?软件中，似然比是一种用于衡量软件性能的重要指标，也是比较STRmix CE版本和STRmix NGS版本性能的合适起点。图1a中所显示的似然比仅包含了三种分析系统都检测过的基因座。而图1b则展示了每种分析系统中所有可检测的基因座。
无论使用哪组基因座来计算似然比，STRmix NGS版本的
似然比比较
在以往关于大规模并行测序技术结合概率混合分析方法的研究中，人们已经预期到且确实观察到了更高的似然比数值，例如[27]。本研究中，当所有系统中的所有基因座都被纳入分析时，从毛细管电泳结果到大规模并行测序结果的似然比增幅最大，约为8个数量级；而仅考虑所有系统共有的基因座时，似然比也平均有约5个数量级的提升。这一结果充分体现了
结论
测序技术有望推动法医DNA分析领域的诸多发展，而本研究也为越来越多的证据所支撑——即对经过测序的STR混合物进行概率基因分型同样属于这一范畴。在似然比、混合物比例和基因型权重这三项核心指标的比较中，STRmix? v2.8和STRmix? NGS v1.1.0的表现相当，都具有出色的混合物解析能力。二者在似然比方面存在的差异
资金支持
本研究没有获得任何来自公共部门、商业机构或非营利组织的资助。
作者贡献说明
Daniela Cuenca：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，数据可视化，方法设计，实验研究，正式分析，数据整理，概念构建。Jeanette Wallin：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，数据可视化，方法设计，实验研究，正式分析，数据整理，概念构建。Kevin Cheng：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，数据可视化，方法设计，实验研究，正式分析，数据整理，概念构建。Kyle Duke：
利益冲突声明
作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：Kevin Cheng与新西兰公共卫生与法医学研究所存在雇佣关系。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系
致谢
作者们希望感谢Jo-Anne Bright、Hannah Kelly和Catherine McGovern在本文的审阅和改进过程中所提供的宝贵帮助。
利益冲突
作者声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：共同作者Kevin Cheng在新西兰公共卫生与法医学研究所、PHF Science（前身为环境科学与研究研究所ESR）工作，同时还参与了相关技术的共同开发工作
