CO2驱动的脲酶促水解过程中pH控制：模型-实验耦合方法

《Industrial & Engineering Chemistry Research》：CO2-Driven pH Control in the Enzymatic Hydrolysis of Urea: A Coupled Modeling-Experiment Approach

　　

酶促生物转化可为传统化学过程提供可持续替代方案，但其活性通常强烈依赖于反应溶液的pH。脲酶催化的尿素水解为氨（ammonia）生产提供了一条温和路径；然而，在无缓冲体系中，该产氨过程会内在地提高pH，从而迅速降低脲酶活性。本研究结合建模与实验，开发了一种用于尿素酶促水解的无缓冲pH控制策略，该策略依赖于气态二氧化碳（CO₂）的溶解。CO₂实际上是酶促尿素水解的副产物，在本研究中被有意加入以调节pH并提高生产效率。研究人员将尿素水解动力学模型与水相酸碱平衡热力学模型耦合，用于分析和设计该过程。采用贝叶斯优化（Bayesian optimization）计算气相中CO₂的最优分压，以实现生产效率最大化。所得概念已通过实验证实，表明这是一种在酶促反应中控制pH且后处理需求最低的实用途径。

该文发表于《Industrial & Engineering Chemistry Research》，围绕尿素酶促水解中pH快速漂移这一关键过程工程问题，提出并验证了以CO₂为调节介质的无缓冲pH控制策略。研究背景在于，酶催化转化虽然具有温和、高选择性和可持续性优势，但其反应速率高度依赖pH条件。脲酶（urease，尿素酰胺水解酶）催化尿素分解生成氨和CO₂，其中氨-铵平衡会显著提升体系碱性，使无缓冲反应液的pH迅速升高至约9，而该区间会明显抑制脲酶活性。传统通过缓冲盐维持pH的方法虽然可行，但会增加体系盐负荷，带来产物纯化和下游分离负担，也可能对酶活性造成不利影响。因此，开发一种无需额外缓冲盐、同时能够维持最适pH范围的控制策略，具有明确的工艺强化与绿色制造意义。

研究人员据此提出：利用CO₂既是反应副产物、又可通过溶于水形成碳酸体系降低pH这一特性，向反应器中主动施加CO₂分压，以抵消尿素水解过程中由氨生成引起的碱度上升。为此，研究构建了一个耦合模型框架，将文献中的半经验脲酶动力学模型与液相酸碱平衡模型、NH₃/CO₂气液传质模型及理想混合间歇反应器物料衡算相结合，用于描述反应进程、pH演化、物种分布与相间交换之间的强耦合关系。研究结果表明，若不实施pH控制，体系状态会迅速偏离脲酶最适活性区；而通过调节CO₂初始分压，可显著改善pH轨迹、维持更高酶活并提升60 min内的尿素转化效果。该工作的重要意义在于证明了CO₂可作为一种可放大的、减少化学添加剂和下游处理需求的pH调节手段，为酶促过程设计、优化与自适应控制提供了可量化基础。

在技术方法上，研究主要采用四类关键手段。其一，采用Fidaleo和Lavecchia提出的改进型米氏方程（Michaelis–Menten）动力学模型，纳入pH依赖活性项、产物抑制项及Arrhenius型温度依赖关系。其二，基于电中性条件建立水相酸碱平衡模型，描述NH₃/NH₄⁺、CO₂/HCO₃^?/CO₃^2?及水自解离平衡，并通过数值求根动态计算pH。其三，构建NH₃与CO₂的气液传质模型，并与间歇反应器质量衡算联立，在Python中用BDF刚性求解器完成数值积分。其四，利用20 mL可加压反应器进行三重复实验，并采用贝叶斯优化（Bayesian optimization）在0–3.5 atm范围内搜索最优初始CO₂分压，以最小化60 min后的残余尿素浓度。实验样本来源为研究人员自建并联可加压反应器体系中的尿素-脲酶反应液，不涉及临床或人群队列。

在“引言（Introduction）”部分，论文系统说明了脲酶体系在工业与环境领域中的应用基础，指出其在废水处理、尿素检测、生物医学装置以及可持续制氨中的潜力。研究人员进一步强调，脲酶活性在接近中性的pH约7附近最高，而无缓冲条件下尿素水解会因产氨而导致pH升高，快速远离最适区间，成为限制反应效率的主要矛盾。由此引出了以外源CO₂实现无盐pH控制的研究动机。

在“尿素的酶促水解（The Enzymatic Hydrolysis of Urea）”与“动力学模型（Kinetic Model）”部分，论文给出了反应主方程以及相关酸碱平衡反应，并明确在稀溶液、近环境条件下忽略氨基甲酸铵（ammonium carbamate）短寿命中间体的积累。动力学方面，研究采用单底物近似，将水视作过量常数，并用改进的米氏表达式描述速率，考虑底物浓度、氨抑制、pH依赖活性及温度效应。研究还引入活性修正参数fac，用于校正本研究所用冻干脲酶粉末的单位质量活性，以实现模型与实际酶制剂的一致化。

在“酸碱平衡模型（Acid–Base Equilibria Model）”部分，研究人员基于温度相关平衡常数和电中性原理计算溶液pH。模型以总氨氮（TAN）与溶解性无机碳（DIC）为核心状态量，借助各组分分数α_i确定NH₃、NH₄⁺、CO₂(aq)、HCO₃^?及CO₃^2?浓度，并通过求解[H⁺]满足电荷守恒。该部分奠定了后续分析pH组成图谱及动态过程耦合的理论基础。

在“气液传质模型（Gas–Liquid Mass Transfer Model）”“反应器模型及主要假设（Reactor Model and Main Assumptions）”和“数值实现与求解策略（Numerical Implementation and Solution Strategy）”部分，论文将NH₃与CO₂在气液两相间的分配通过Henry定律和体积传质系数k_La联系起来，并构建理想混合、等温、定容间歇反应器模型。研究假定液相酸碱平衡瞬时建立，而酶促水解速率遵循半经验动力学式。数值求解采用SciPy中的BDF法积分常微分方程，并在每个时间步通过Brent算法计算满足电中性的pH，从而稳定处理多时间尺度耦合系统。

在“优化方法学（Optimization Methodology）”部分，论文将60 min后的残余尿素浓度设为优化目标，决策变量为初始CO₂分压。由于系统包含刚性常微分方程、嵌套pH求根和非光滑黑箱目标函数，传统依赖梯度的非线性规划方法难以稳定求解，因此研究采用无导数贝叶斯优化。这一处理不仅符合问题数值特征，也为复杂多相酶促系统中的条件筛选提供了可推广的计算策略。

在“pH的作用（The Role of pH）”部分，研究首先通过模型定量分析了pH对酶活的影响。结果显示，在底物饱和且无产物抑制的理想条件下，反应速率在pH约7附近达到最大，而当pH升至9时，预测速率较最优值降低约一个数量级。随后，研究将动力学与酸碱平衡解耦，绘制35 °C下TAN与DIC决定的pH分布图，并叠加尿素水解的化学计量轨迹。结果表明，该轨迹斜率与最优pH带明显不匹配，说明无论初始组成如何，体系都会迅速偏离最佳反应区。由此得出结论：维持脲酶高活性必须实施主动pH调控，而CO₂补加能够通过提高DIC、减缓轨迹偏移来实现这一目标。

在“实验结果（Experimental Results）”部分，研究比较了高效液相色谱（HPLC）与商用氨检测试剂盒两种离线分析手段。结果表明，在无或低CO₂条件下，两者对最终尿素浓度的测定一致性较好；但在较高CO₂条件下，HPLC色谱基线稳定性变差，影响定量可靠性，因此后续研究采用氨检测试剂盒进行尿素转化表征。随后，研究考察不同CO₂过压下60 min后的尿素浓度与pH变化，发现即使较小幅度的CO₂添加也能提高尿素转化率；同时，随着CO₂压力增加，体系pH逐渐下降。这表明CO₂通过改变反应pH有效提升了水解性能。论文还结合文献指出，相较于磷酸盐缓冲液可能带来的竞争性抑制，CO₂策略避免了外加缓冲组分，更有利于简化工艺。

在“模型参数化（Model Parameterization）”部分，研究以实验获得的最终尿素浓度数据为基础，对两个未知参数——总体积传质系数k_La和酶活修正因子fac——进行非线性回归拟合。拟合结果给出k_La = 0.0092 ± 0.0032 min^?1，fac = 40.0434 ± 6.3643，并报告调整后的决定系数R² = 0.90，说明模型能够较好重现实验观测。该结果证明，尽管系统存在非线性和参数耦合，经过适当参数辨识后模型具备良好描述能力。

在“验证与基于模型的设计（Validation and Model-Based Design）”部分，研究进一步利用模型计算不同初始尿素浓度下的最优初始CO₂分压，并通过贝叶斯优化获得相应的最小残余尿素浓度。研究挑选其中两个代表性工况，即0.015 M和0.030 M初始尿素浓度，开展实验验证。结果显示，模型预测与实验测量吻合良好，不仅验证了优化结果的可靠性，也说明该模型能够用于揭示反应过程中物种浓度和pH的时间演化规律。研究据此认为，利用CO₂分压进行pH调控具有明确的过程强化潜力，并可进一步扩展至时间变化的CO₂投加控制。

论文讨论部分主要围绕模型适用性、参数敏感性与工程实现展开。研究认为，该模型在分析、理解和设计反应过程方面表现出良好的预测能力，特别是在说明CO₂分压如何被有效利用以控制pH并提高生产率方面具有较强解释力。同时，论文也指出模型性能对两类参数较为敏感：一是不同批次酶制剂带来的活性差异，二是受装置几何结构及搅拌/鼓泡条件影响的k_La变化。因此，在实际设计和放大中，需要对这些关键参数进行准确估计，这也是未来实施基于模型控制时必须面对的不确定性来源。

研究结论部分可概括为：本研究提供了气态CO₂可在无缓冲条件下用于尿素酶促水解pH控制的实验证据。通过将机理性动力学模型与酸碱平衡热力学和气液传质过程耦合，研究建立了能够表征反应进展、pH演化与相间相互作用强耦合关系的综合反应器模型。建模结果清楚表明，若不实施pH调节，体系将迅速偏离脲酶活性的最优pH范围；而受控加入CO₂可通过提高DIC并将体系推向近中性条件，维持较高酶活并改善转化效果。实验验证证实，即便适度的CO₂过压也能通过降低pH、稳定酶性能而显著促进尿素水解。参数估计结果支持模型预测能力，贝叶斯优化则证明了在非线性、非光滑耦合系统中识别最优CO₂分压的有效性。总体而言，该研究确立了基于CO₂的pH控制作为传统缓冲策略替代方案的可行性与可扩展性，并为pH动态主导的酶促过程设计与优化提供了有力的方法学基础。