清除骨缺损处的老化微环境能够有效促进骨缺损的修复

《Journal of Translational Medicine》：Removal of aging microenvironment of bone defects can effectively promote bone defect repair

　　

摘要

背景

骨缺损仍是骨科领域面临的重大挑战。尽管间充质干细胞在再生医学中被广泛应用，但其在体内的治疗效果往往不尽如人意。有新证据表明，局部微环境，尤其是与年龄相关或由损伤引发的细胞衰老，可能会削弱间充质干细胞的功能。在本研究中，我们探讨了骨损伤后形成的衰老血管微环境如何影响间充质干细胞的增殖与分化，以及其中可能涉及的促进再生和清除衰老微环境的机制。

方法

我们在3个月大的SD大鼠身上制造股骨滑车区缺陷（每组6只），通过SA-β-Gal染色、p16/CD31免疫荧光检测以及Cdkn1a/Cdkn2a基因表达情况，来观察细胞衰老随时间的变化。首先分离出原始内皮细胞，然后用400 μM的过氧化氢处理45分钟以诱导其衰老。接着将间充质干细胞与这些衰老的内皮细胞一起培养在浓度为2 mg/mL、压力约为5 kPa的3D胶原I水凝胶中。从DrugAge筛选中选出的槲皮素以20 μM的浓度被加入含4 wt%热敏感成分的水凝胶中，从而实现7天的持续释放。在损伤后1周和4周，通过μCT、组织学检测和免疫荧光技术来评估骨修复情况。

结果

骨缺损会引发两阶段的细胞衰老反应：1周时，早期的衰老主要发生在缺陷周围的骨细胞中；而到4周时，新生血管中的内皮细胞则出现明显的衰老现象。衰老的内皮细胞会显著损害间充质干细胞的生物学功能，降低其迁移能力、软骨生成能力（通过Safranin O染色强度判断）以及矿化能力（通过Alizarin Red染色判断），所有这些指标的差异均具有极显著的统计意义。通过热敏感水凝胶将槲皮素局部递送至体内后，可清除约81%的p16?阳性内皮细胞，进而促进骨修复，使血管密度相对于未添加槲皮素的对照组有所提升，这一差异也具有极显著的统计意义。在骨缺损的早期阶段，衰老的细胞主要是位于缺陷周围组织中的骨细胞；而在后期，当微环境没有发生变化时，新生组织和血管中的血管内皮细胞衰老现象最为明显。我们成功诱发了内皮细胞的衰老，并进一步研究了衰老内皮细胞对间充质干细胞功能的影响，发现衰老的内皮细胞会导致间充质干细胞在各项功能上的表现下降，包括增殖能力、软骨生成能力、成骨能力、组织修复能力以及矿化能力。通过构建槲皮素热敏感水凝胶持续释放系统来改善骨缺损处的衰老微环境，能够有效提升间充质干细胞的治疗效果，加速骨缺损的修复。

结论

骨损伤会形成一种衰老的血管微环境，这种环境会严重干扰间充质干细胞介导的再生过程。通过使用可持续释放槲皮素的方法针对性地恢复这种微环境的活力，能够有效恢复间充质干细胞的功能，显著加快骨组织的重建速度。这些研究结果表明，衰老微环境是改善基于间充质干细胞的骨缺损治疗策略的关键靶点。