综述：青光眼中的神经炎症：大量细胞通路和参与者

《Mammalian Genome》：Neuroinflammation in glaucoma: a myriad of cellular pathways and players

　　

青光眼是一种复杂的神经退行性疾病，包含多种亚型，但其共同特征均为视网膜神经节细胞（RGCs）的进行性功能失调与丢失，最终可导致视力损害乃至失明。眼内压（IOP）升高是青光眼的主要危险因素；然而，IOP升高既非青光眼性神经退行性变的必要条件也非充分条件，因为部分患者可出现高IOP但不发生青光眼，而部分患者则在IOP正常的情况下发生青光眼。目前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的治疗方案大多局限于降低IOP和最小化风险的手段。因此，靶向青光眼病理生理学的其他方面具有紧迫的必要性。本文将神经炎症广义地定义为中心神经系统（CNS）内的免疫相关反应，常涉及小胶质细胞和星形胶质细胞，并可能包括外周免疫细胞浸润。越来越多的证据表明，神经胶质细胞参与人类组织和小鼠模型中青光眼的发生与发展。迄今为止，大多数青光眼小鼠模型显示，小胶质细胞和星形胶质细胞在RGC明显丢失之前的青光眼性神经退行性变早期即出现反应性活化。然而，越来越多的证据表明，人类和小鼠的神经胶质细胞在应对神经退行性变时表现出不同的表型。因此，迫切需要将研究扩展至新一代人类细胞培养模型。在本综述中，研究人员讨论：1）人类青光眼中神经炎症过程的证据；2）青光眼相关神经炎症的模型；以及专门针对3）先天免疫细胞驱动和4）大胶质细胞驱动过程的证据。

引言
青光眼导致RGCs的进行性丢失和视力损害，最终可导致失明。年龄增长和IOP升高是发生青光眼的主要危险因素。近期大规模全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出数百个风险位点，其中部分位点与免疫相关过程相关，且与神经胶质细胞群体中高度表达的基因有关。在青光眼中，三个主要的CNS区域受到关注，包括视网膜、视神经头（ONH）和视神经（ON）。越来越多的证据表明，人类青光眼患者和小鼠模型中存在伴随的脑区特异性改变，其镜像反映了随疾病进展而发生的RGC丢失。在青光眼中，视网膜、ONH和ON中的胶质细胞在发病早期即受到扰动，因此这些细胞处于介导青光眼性神经退行性变早期阶段的有利位置。

神经炎症驱动人类青光眼病理的证据
数百个单核苷酸多态性（SNP）可增加原发性开角型青光眼（POAG）的风险，包括与免疫反应相关基因中的SNP。除这些风险变异外，编码肿瘤坏死因子（TNF）受体相关因子NF-κB激活剂（TANK）结合激酶1（TBK1）的基因拷贝数变异已在多个人群的早发性正常眼压性青光眼中被鉴定。TBK1具有多种细胞功能，包括调节神经炎症相关分子和通路，包括TNF、NF-κB和干扰素（IFN）信号。OPNE50K突变与人类和小鼠的正常眼压性青光眼相关，该蛋白已知连接自噬和免疫信号，包括调节NF-κB和IFN信号。近期整合大规模多族裔GWAS数据与单核RNA测序（snRNA-seq）实验的工作，已预测介导青光眼风险的潜在因果基因和细胞类型。POAG的GWAS位点（独立于IOP）与神经胶质细胞高度表达的基因相关，包括视网膜、视神经和ONH中的星形胶质细胞、Müller胶质细胞和少突胶质细胞。来自青光眼供体死后视网膜和ONH组织的证据清楚地显示，相对于对照组织，小胶质细胞、星形胶质细胞和Müller胶质细胞发生显著的形态学改变。在ONH中，小胶质细胞改变吞噬标志物CD68和主要组织相容性复合体II类（MHC II）蛋白HLA-DR的表达水平，同时星形胶质细胞和小胶质细胞中TNF水平升高。连接蛋白43（Cx43）在青光眼性ONH和视网膜中均上调，表明青光眼发病与星形胶质细胞间通讯改变相关。

小胶质细胞和外周细胞在青光眼发生发展中的复杂作用
健康与青光眼视网膜中的小胶质细胞
小胶质细胞是CNS的驻留性先天免疫细胞。在健康组织中，小胶质细胞对于维持突触和提供神经营养支持具有重要作用。在健康的视网膜中，小胶质细胞通常被称为稳态性或静息态小胶质细胞，常与Tmem119、P2ry12和HexB的表达相关。小胶质细胞表达多种模式识别受体，包括Toll样受体（TLR）。这些受体激活驱动小胶质细胞从稳态向活化状态转变的关键通路。在青光眼中，小胶质细胞通常被视为轴突损伤的初始反应者。例如，在使用DBA/2J小鼠（一种慢性青光眼性眼高压遗传模型）的一项研究中，小胶质细胞在视网膜和ONH中于3个月时即被激活——大约在RGC开始死亡前6个月。

小胶质细胞转录多样性
开创性的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究鉴定了神经退行性疾病期间脑内小胶质细胞的多样化转录状态，这些状态可能执行广泛的功能。研究最深入的小胶质细胞状态依赖于髓样细胞触发受体2（TREM2）的活化——常被称为疾病相关小胶质细胞（DAM）。在青光眼中，DAM样小胶质细胞在病理发生中起关键作用。TREM2是一种表面受体，可结合多种损伤相关分子模式（DAMPs）——其中许多在青光眼早期即已存在。载脂蛋白E（APOE）是一种脂质转运蛋白，已被证明与TREM2相互作用以产生DAM表型。Apoe缺失在微珠诱导的青光眼中可保护RGC免于丢失，并抑制视网膜DAM特征，包括Spp1、Lgals3和Gpnmb的表达。Optn E50K小鼠视网膜的scRNA测序揭示了一个以Cd74表达升高为特征的DAM样小胶质细胞群体，该群体显示MHC-II信号通路的富集。在单独的研究中，衰老的Optn E50K视网膜显示I型干扰素信号通路及相关基因（包括Ifitm3、Oas12和Irf7）在小胶质细胞中的下调。干扰素反应性小胶质细胞（IRMs）的分类基于I型干扰素特征。近期在Optn E50K小鼠中的工作通过单细胞测序显示，在RGC丢失窗口期间神经炎症过程处于活跃状态。

cGAS-STING通路与RGC退化
cGAS-STING通路是一种先天免疫系统反应，可检测胞质双链DNA（dsDNA），包括可从细胞损伤或应激中释放的自身DNA。cGAS（GMP-AMP合酶）作为核酸传感器，通过在胞质中结合DNA并在响应中合成第二信使2'3'-环状GMP-AMP（cGAMP）而发挥作用。cGAMP与干扰素基因刺激因子（STING）蛋白结合，后者募集TBK1以磷酸化IRF3，从而促进干扰素刺激基因和炎性细胞因子（如TNF）的转录。有趣的是，cGAS-STING通路也已在青光眼小鼠模型中被报道激活，并且在终末期青光眼患者中亦存在。在视网膜缺血/再灌注小鼠模型中，dsDNA在损伤后释放，主要见于视网膜小胶质细胞的胞质中。在CONC或微珠诱导的眼高压后，小胶质细胞显示显著的cGAS-STING通路激活。小胶质细胞中Sting1的遗传缺失已被报道可减轻CONC后的RGC丢失，并诱导视网膜大胶质细胞的反应性。过活跃的cGAS-STING-TBK1增强了RGC丢失，而CONC后抑制TBK1显示对RGC丢失具有保护作用。因此，靶向青光眼中的cGAS-STING-TBK1通路及其下游IFN信号可能是减缓神经炎症进展和随后RGC丢失的治疗有益途径。

巨噬细胞和单核细胞的外周浸润
神经炎症的复杂性可能因与周围先天性和适应性免疫系统的直接相互作用而进一步加剧。青光眼神经炎症的重要贡献因素被认为是巨噬细胞和单核衍生细胞浸润至ONH——早期损伤的关键部位。在DBA/2J小鼠的ONH中，单核细胞在RGC丢失之前即已存在，但在正常眼压对照组中基本不存在。多项研究通过操纵单核细胞募集来评估这些细胞在青光眼性神经退行性变中的作用。Itgam（CD11b，单核细胞外渗所需的粘附分子）的遗传消融减少了DBA/2J小鼠的青光眼性神经退行性变。同样，使用工程化肽聚糖DS-SILY对血小板-单核细胞粘附进行药理学抑制，可减少免疫细胞向眼内的外渗，并延迟RGC胞体和轴突的丢失。眼特异性X射线辐射抑制单核细胞进入ONH并保护免受青光损伤。在人类疾病中，正常眼压性青光眼患者表现出单核细胞趋化蛋白-1的血液水平升高，这暗示外周单核细胞募集通路在青光眼发病中的潜在激活。

适应性免疫系统的参与
来自人类死后组织的证据表明适应性免疫系统也可能在视网膜内被激活。青光眼视网膜表现出RGC层内IgG沉积增加，伴随CD27⁺/IgG⁺浆细胞和偶见的T淋巴细胞，这与外周免疫细胞被募集至视网膜一致。IgG沉积与活化的小胶质细胞共定位，并可能至少部分解释检测到的TNFα、IL1β、IL6和IL8水平升高。来自青光眼供体小鼠的纯化脾CD3⁺ T细胞（而非CD19⁺ B细胞）的过继转移至健康对照小鼠足以诱导RGC丢失，而从健康或免疫缺陷性青光眼供体转移则不导致RGC丢失。这些数据表明，观察到的适应性免疫介导的神经退行性变是由驻留小胶质细胞放大而非广泛的淋巴细胞浸润所致。

细胞外信号——趋化因子和细胞因子
consistently，促炎信号分子在人类青光眼患者和青光眼小鼠模型中上调。补体系统是促炎环境的主要贡献者。在经典的补体激活途径中，C1Q的激活导致膜攻击复合物的形成，该复合物由C5b、C6、C7、C8和C9组成，可结合靶细胞膜以诱导裂解和死亡。有趣的是，DBA/2J小鼠不表达功能性C5蛋白，阻止膜攻击复合物的形成。相反，C3a作为促炎信号分子，通过募集小胶质细胞和单核细胞并抑制IL10来促进慢性炎症。与补体系统激活同时发生的是其他关键炎性分子的上调，即TNF和IL1α。TNF是青光眼组织中促炎信号的主要成分。除作为小胶质细胞中促炎表型的强驱动因子外，TNF还可通过无菌α和TIR基序含蛋白1（SARM1）通路以神经毒性方式影响RGC。

大胶质细胞保护功能丧失和/或有害作用
星形胶质细胞在青光眼中的神经保护或神经毒性——异质性功能的争议
星形胶质细胞被认为是CNS中最丰富的胶质细胞，现在已充分认识到星形胶质细胞执行多种功能以支持神经和血管过程。区域差异在不同区域的星形胶质细胞中是显著的，星形胶质细胞采用独特的区域依赖性功能。Ribotag实验提供了证据，表明即使在视觉系统内，视网膜、ON和ONH中的星形胶质细胞在分子上也是不同的。面对神经损伤时，星形胶质细胞以特定方式响应，这取决于损伤类型。经典地，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和形态学变化被用来表示星形胶质细胞反应性，这在青光眼死后和摘除眼中相对于对照有所增加。

一项里程碑式的研究提供了证据，表明星形胶质细胞可以 adopting a neurotoxic "A1" state in response to microglial-derived factors including IL1α, TNF, and C1Q，或采用神经保护性"A2"状态。后来的研究显示A1星形胶质细胞产生的一种毒素主动杀死应激/损伤的RGC，但不足以杀死健康的RGC。然而，星形胶质细胞可以同时表达A1和A2状态的标志物，这种二元分类系统可能无法反映星形胶质细胞反应的真实异质性。近期工作报道了对CONC反应的两种反应性星形胶质细胞簇——可通过其补体组分3（C3）的表达来区分——C3此前被鉴定为A1而非A2星形胶质细胞的标志物。在微珠诱导的眼高压模型中，关于A1星形胶质细胞诱导的报告存在未解决的差异。Mazumder等人在眼高压后7天或30天的ON或ONH中未检测到A1或A2特征的诱导。Zhu等人报道了眼高压后4周ON中吞噬基因的增加，并在青光性ON中通过可视化星形胶质细胞内的轴突衍生线粒体材料证实了吞噬性星形胶质细胞的存在。有趣的是，Mazumder及其同事报告他们无法在星形胶质细胞中检测到先前与青光眼相关的典型神经炎症特征，且这些分子中的许多存在于输入组分而非星形胶质细胞核糖体富集组分中。体外实验提供了证据，表明人多能干细胞（hPSC）衍生的OPTN（E50K）星形胶质细胞表现出异常的细胞功能，包括相对于等基因对照组增加炎性和减少细胞周期通路表达。

鉴于在CONC中神经保护性星形胶质细胞已在神经毒性星形胶质细胞上游被鉴定，Guttenplan和Liddelow等人归因于星形胶质细胞的毒性功能可能依赖于保护性星形胶质细胞的失败。有趣的是，许多星形胶质细胞在微珠模型中IOP升高后的ONH中不表现反应性，表明亚群可能在任何给定时间响应。增加这种复杂性的是，星形胶质细胞形成可跨越大脑内和双眼之间大距离的相互连接网络。这些网络使得IOP升高相关的微珠损伤后，受影响的和未受影响的眼睛之间可以通过Cx43共享代谢资源。虽然这一过程看似保护性并可减少损伤组织中的青光眼性神经退行性变，但它导致对侧组织发生使其更容易受到未来损伤的改变。在这方面，Cx43抑制在青光眼性损伤的早期阶段（IOP升高后4周）使预后恶化。然而，这似乎会发生转变，在IOP升高后8周，Cx43抑制对受影响眼睛的RGC丢失具有保护性。

Müller胶质细胞在青光眼发病中的作用
Müller胶质细胞是视网膜中最丰富的大胶质细胞，在健康和疾病中显示多种调节功能。当Müller胶质细胞应对病理时，这些细胞显著上调GFAP，类似于星形胶质细胞。活化的Müller胶质细胞已在青光眼死后视网膜相对于对照中被注意到，这在RGC明显丢失之前即发生。Müller胶质细胞被认为快速响应局部环境变化，并可向环境中释放ATP，激活RGC和小胶质细胞上表达的嘌呤能受体。来自青光眼视网膜的Müller胶质细胞中TNF表达增加的报道显示，抑制TNF信号可减少RGC丢失。除对神经炎症过程的直接作用外，Müller胶质细胞在健康视网膜中执行多种调节功能。例如，钾离子（K⁺）通道Kir4.1在青光眼视网膜的Müller胶质细胞中被下调。Kir4.1的减少与神经功能改变和K⁺缓冲减少相关，破坏了Müller胶质细胞的功能。越来越多的工作表明，Müller胶质细胞在某些脊椎动物物种（包括斑马鱼）中表现出神经发生潜能，但在哺乳动物脊椎动物中则没有。

青光眼、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变的共同机制以及神经炎症的作用
全球最常见的眼病包括青光眼、年龄相关性黄斑变性（AMD）和糖尿病视网膜病变（DR）。这三种视网膜疾病之间存在若干已知的共同风险因素，包括糖尿病、年龄和肥胖。近期工作已鉴定出这三种疾病之间的共同遗传风险因素，包括CDKN2B-AS1变异。CDKN2B-AS1是一种长链非编码RNA（lncRNA），据报道可调节衰老、炎症和代谢。在这三种疾病的模型中，神经炎症均有充分记录，包括小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。TNF和补体级联也被牵涉到所有三种疾病中，表明视网膜神经退行性变的一个共同特征可能包括这些通路的激活。除促炎细胞因子产生的相似性外，还存在导致氧化应激增加的共享线粒体功能异常。新兴工作已强调适当的线粒体和代谢功能对于神经退行性疾病模型中小胶质细胞反应至关重要。当受损线粒体未得到适当清除时，可导致线粒体DNA的细胞外释放，进而促进小胶质细胞中cGAS-STING通路的激活，从而促进神经炎症。重要的是，cGAS-STING通路已被牵涉到DR、AMD和青光眼中。

建模青光眼相关神经炎症——体内模型
遗传模型中慢性青光眼性神经退行性变
DBA/2J小鼠发生与年龄相关的、不同步的眼高压。IOP升高约在8月龄开始，持续至12-13月龄。这种IOP升高是虹膜疾病的结果，包括虹膜基质萎缩和虹膜色素播散。虹膜基质萎缩是Tyrp1基因突变（Tryp1b）的结果，虹膜色素播散由Gpnmb基因突变（GpnmbR150X）引起。这些表型与人类的色素性青光眼相似。IOP升高导致ON损伤和RGC死亡。到12月龄时，约70%的ON严重受损。RGC死亡以楔形模式通过凋亡发生，且双眼不对称。

B6.Lmx1b V265D小鼠
LIM同源域转录因子1β（LMX1B）突变导致甲髌综合征（NPS）。约29%的40岁以上NPS患者发生眼高压和/或青光眼。与人类和小鼠一样，Lmx1b突变对眼部异常具有不完全外显率。Lmx1b突变可导致虹膜角膜角的多种影响。到10月龄时，这些小鼠以高外显率发生严重的ON损伤，部分小鼠发生高IOP。

OPTN E50K小鼠
OPTN突变导致小鼠和人类的正常眼压性青光眼。已生成表达OPTN E50K疾病相关变异的小鼠。第一个转基因过表达小鼠模型在16月龄时表现出视网膜退行性变。更近的转基因小鼠模型以约生理水平表达人OPTN E50K，具有看似正常的视网膜发育。这种人源化模型在18月龄时表现出RGC功能下降、损伤和细胞丢失。无论使用哪种OPTN小鼠模型，它们似乎都以18月龄时的视觉功能下降和RGC丢失为特征。

实验诱导的青光眼性神经退行性变模型
微珠阻塞模型
可通过阻塞房水外流来升高小鼠模型中的IOP。这可通过注射微珠阻断常规流出通道来实现。原始工作使用聚苯乙烯珠，尽管更近的工作引入了磁性微珠。产生的IOP升高可持续7天至6周，这取决于实验条件。随后发生青光眼性神经退行性变。IOP增加（约30-38%）与轻度/中度眼高压人类患者眼中观察到的相似。视网膜胶质细胞激活已在微珠诱导的眼高压后被注意到，包括小胶质细胞和星形胶质细胞。

控制性视神经挤压
控制性视神经挤压（CONC）是对小鼠ON的机械性损伤，旨在复制IOP升高后观察到的RGC轴突损伤。ON的一只眼使用自夹闭镊子挤压短时间。挤压部位的精确位置通常靠近眼睛，眼球后1-2毫米处较常见。该程序导致RGC的快速、同步死亡，RGC丢失在CONC后3天即可检测到，几乎所有RGC丢失发生在程序后3周内。CONC导致小胶质细胞活化、大胶质细胞活化和白细胞浸润。

通过结合青光眼相关神经炎症提高人类细胞模型的可转化性
3D视网膜类器官和RGC分化
患者来源的hPSC携带青光眼相关突变，结合CRISPR/Cas9基因组编辑方法学，能够生成等基因对照和精确工程的青光眼模型。逐步分化方法已能够生成3D视网膜类器官，重现人类视网膜发生——产生所有主要视网膜细胞类型。有趣的是，从POAG患者来源的hPSC分化的视网膜类器官揭示了RGC特异性转录改变，而那些携带OPTN（E50K）突变的hPSC表现出RGC内层中显著的LC3积聚。

iPSC模型研究青光眼性神经元-胶质相互作用
由于获取人体组织有限，体外hPSC模型已成为研究神经元-胶质相互作用的必要工具。hPSC来源的星形胶质细胞已被证明可增强hPSC来源RGC的成熟和功能特性。疾病建模揭示，携带青光眼相关OPTN（E50K）突变的星形胶质细胞表现出自噬功能障碍和炎性转录变化，并在共培养系统中促进RGC的退行性表型。人iPSC衍生的小胶质细胞研究也已经开始。已建立的方案能够将hPSC分化为小胶质细胞，这些模型已被广泛用于模拟神经炎症和神经退行性变。重要的是，虽然非刺激状态的hPSC来源小胶质细胞对RGC稳态显示出有益作用，但LPS活化的小胶质细胞导致RGC的退行性表型，包括形态学和功能缺陷。

RGC区室化建模
RGC是高度极化和区室化的神经元，具有不同的胞体树突和轴突域，支持专门的功能，其中轴突在ON损伤和青光眼中特别脆弱。微流体装置能够分离神经元的轴突区室，已成为增强RGC极化和实现神经元区室选择性操作的强大工具。使用这些系统，选择性轴突损伤重现了关键的青光眼特征，包括顺行运输受损、轴突静脉曲张和进行性退行性变。此外，OPTN（E50K）突变RGC表现出轴突生长受损和轴突运输效率降低，轴突RNA测序突出了青光眼性RGC轴突特异性的疾病相关转录组改变。超越微流体系统，人类视觉系统的3D模型提供了在更具生理学相关性的多细胞环境中研究RGC生物学和退行性变的互补平台。