TGIF2介导的转录抑制协调神经发生启动态与神经干细胞维持

《SCIENCE ADVANCES》：Transcriptional repression by TGIF2 coordinates neurogenic priming and neural stem cell maintenance

　　

摘要：干细胞通过平衡自我更新与分化来决定命运。启动态（priming），即分化相关基因的低水平表达，使干细胞保持未分化状态并使子代细胞能快速上调分化基因。本研究探究神经发生过程中的转录启动态以寻找关键调控因子。通过对前脑不同区域神经干细胞（neural stem cells, NSCs）和神经元的转座酶可及染色质测序（assay for transposase-accessible chromatin using sequencing, ATAC-seq）及RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq），研究人员鉴定出数百个在NSCs中染色质开放但低表达的神经元分化基因。全前脑候选转录因子（transcription factors, TFs）分析指向转化生长因子β诱导同源框因子2（transforming growth factor–β–induced homeobox factor 2, TGIF2）这一转录抑制因子。研究表明，TGIF2通过与SIN3转录调节家族成员A（SIN3 transcription regulator family member A, SIN3A）/组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）共抑制复合物互作，结合并抑制NSCs中的神经元分化基因。体外与体内功能获得及缺失实验显示，TGIF2维持NSC身份、减缓神经元分化，并调控NSCs中超过半数启动态神经元分化基因。综上，本研究确定了跨区域和阶段的启动态基因表达谱，并将TGIF2鉴定为神经发生NSC命运的关键调控因子。

论文解读——《TGIF2介导的转录抑制协调神经发生启动态与神经干细胞维持》

本研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。神经干细胞（neural stem cells, NSCs）需平衡自我更新与分化，其中谱系启动态（lineage priming）——即在完全定向分化前表观遗传、转录或翻译水平上预先准备分化相关基因——是干细胞快速响应分化信号且保持可塑性的重要机制。在NSCs中虽已知存在转录水平的启动态（神经元分化基因染色质开放但低表达），然而具体调控此启动态的转录因子（transcription factors, TFs）尤其中枢性转录抑制因子仍不清楚，经典通路如NOTCH和REST不能完全解释该选择性抑制且保持启动态的现象。因此，研究人员旨在系统鉴定小鼠前脑神经发生过程中NSCs的启动态基因及其调控转录因子，并阐明TGIF2在NSC维持与神经发生启动态中的功能与分子机制。

研究人员以胚胎小鼠（E14与E18）大脑皮层及外侧神经节隆起（lateral ganglionic eminence, LGE）为对象，分选Prominin1⁺（PROM1⁺）NSCs和PSA-NCAM⁺神经元，开展ATAC-seq与RNA-seq筛选皮质神经发生启动态（cortical neurogenic primed, CNP）基因，进而通过基序富集与表达筛选锁定TGIF2；通过体外E12皮层原代培养进行TGIF2敲低（knockdown, KD）与过表达（overexpression, OE）及结构域突变/磷酸化位点突变实验，结合免疫荧光标记PAX6（NSC）、T-Box brain protein 2（TBR2/Eomes，神经元祖细胞）和TUBULIN βIII（TUBB3，神经元）评估细胞命运；通过子宫内电转染（in utero electroporation, IUE）在体OE及CRISPR-Cas9敲除（knockout, KO）验证；采用Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease（CUT&RUN）鉴定TGIF2a基因组结合位点；通过免疫共沉淀-质谱（coimmunoprecipitation–mass spectrometry, co-IP–MS）鉴定互作蛋白；对IUE后FACS分选GFP⁺细胞进行单细胞RNA-seq（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）及拟时分析；对FACS分选Prominin1⁺NSCs进行KO后bulk RNA-seq分析。

Identification of neurogenic primed genes across forebrain regions

研究人员对E14与E18小鼠大脑皮质和LGE分选NSCs（PROM1⁺）及E14神经元（PSA-NCAM⁺）行RNA-seq和ATAC-seq，定义神经元高表达而NSC中低表达但染色质可及且在E18 NSC向胶质发生转换时染色质关闭的基因集为CNP基因（433个），GO富集于轴突发生和突触组装等神经元分化过程，表明皮质NSCs在完全激活前已携带广泛的神经发生程序（开放染色质）。进一步筛选在E14 NSC高表达且基序在E14→E18 NSC关闭区富集的TFs，并经区域差异表达过滤获8个泛前脑神经发生启动因子，TGIF2为其中之一。

Identification of TFs in regulating neurogenic NSC fate

比较E14与E18皮质及LGE NSCs转录组与染色质可及性，筛选在E14两区高表达、E18 LGE高于E18皮质、且E14两区无差异的TFs，并与ATAC-seq基序分析取交集，唯一重叠TF为Tgif2。原位杂交显示Tgif2强表达于脑室区（ventricular zone, VZ）NSCs并随发育下调，提示其潜在NSC维持功能。

TGIF2 promotes NSC maintenance in vitro

E12皮质原代培养中，TGIF2 KD显著降低PAX6⁺NSC比例、增加TUBB3⁺神经元比例，加速过早分化；TGIF2a/b OE（尤其TGIF2a）增加PAX6⁺NSC比例、减少TUBB3⁺神经元，延迟分化。7天检测显示TGIF2a OE增加TBR2⁺祖细胞比例，证实TGIF2延缓分化并维持NSC状态。

TGIF2 function is dependent on its repressor domain and phosphorylation

序列比对显示TGIF2含保守SIN3A相互作用域（SIN3A-interacting domain, SID）。TGIF2a-KRAB（更强抑制域）OE增强NSC维持与分化抑制，TGIF2a-VP64（激活域）促进分化；SID点突变使TGIF2丧失功能（表型同KD）。MAPK磷酸化位点苏氨酸→甘氨酸双突变体（TGIF2a^TTGG）OE无表型，表明TGIF2功能依赖其磷酸化状态及通过SID介导的转录抑制。

TGIF2 interacts with HDAC1/2 and SIN3 corepressor complex

co-IP-MS显示TGIF2a与SIN3A共抑制复合物核心组分HDAC1/HDAC2、RBBP4/7及核膜相关蛋白互作；IP-Western blot验证TGIF2-Flag可pull down内源性HDAC1、HDAC2和SIN3A，确认TGIF2通过招募SIN3A-HDAC复合物行使转录抑制。

TGIF2 OE in vivo expands the NSC pool and delays neuronal positioning

E13 IUE后E16分析，TGIF2a/b OE显著增加VZ区PAX6⁺NSC比例及增殖细胞（phospho-histone H3, pH3⁺），减少皮质板（cortical plate, bin5）成熟神经元，部分细胞滞留于中间带（bin3，NEUROD2⁺未成熟神经元区），证实在体TGIF2扩展NSC池、延迟神经元分化与迁移。

TGIF2 target genes include neuronal differentiation and neurogenic primed genes

CUT&RUN鉴定10,688个TGIF2a结合峰，主要位于内含子与基因间区（调控元件），关联5,783个靶基因，GO富集"神经发生"等。433个CNP基因中225个（51.9%）被TGIF2直接结合，显著高于随机（置换检验P≈0），且TGIF2结合并处于启动态的CNP基因附近ATAC-seq信号低于其他组，支持TGIF2直接结合并抑制启动态神经元分化基因、降低其染色质开放性。

TGIF2 OE slows down neuronal differentiation shown by single-cell RNA-seq

IUE后36 h FACS分选GFP⁺细胞scRNA-seq，注释NSC（Pax6⁺、Sox2⁺、Fabp7⁺径向胶质细胞）、NPC（Eomes⁺/Neurog2⁺）及迁移/分化神经元。TGIF2 OE细胞中NSC簇比例增高，上/下层层神经元（upper/deep layer neurons, UL/DL neurons）比例降低；差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）以下调为主且多为CUT&RUN靶基因，约半数TGIF2结合CNP基因下调。计算成熟评分（maturation score）显示TGIF2 OE细胞成熟程度更低。RNA速率（RNA velocity）与CellRank拟时分析显示TGIF2 OE细胞滞留于早期分化状态、延缓向上/深层神经元命运分配。RegVelo推断TGIF2负调控FEZF2、BCL11B等DL神经元命运TFs，加权模拟TGIF2a OE偏向NSC与UL神经元命运。

CRISPR-mediated knockout of TGIF2 promotes neuronal differentiation

E13 IUE Cas9+gRNA靶向Tgif2 exon2，E16分析显示KO细胞更多迁入皮质板、VZ区PAX6⁺NSC减少，促进分化。KO NSCs bulk RNA-seq显示上调基因富集"胶质发生正向调控"（如Egfr、Stat3），部分神经发生基因因Tgif1代偿性上调未去抑制；CNP基因在DEGs中显著过代表征TGIF2（及部分TGIF1补偿）调控CNP基因。

讨论（结论翻译）

本研究通过前脑NSCs与神经元RNA-seq和ATAC-seq提供了神经发生与胶质发生启动态数据库。鉴定出的皮质神经发生启动态基因在NSCs中染色质开放低表达，E18向胶质发生时关闭。TGIF2为泛神经发生TF，结合并抑制超半数CNP基因，作为分子"刹车"通过磷酸化依赖的SID结构域招募SIN3A-HDAC共抑制复合物，主动抑制神经元（及部分胶质）分化基因以维持NSC未分化态并精细调控皮质发育时序。TGIF2结合位点富集神经发生TF（ASCL1、NEUROG2、NEUROD2等）基序，可能通过占位阻断proneural TFs接入而防止过早分化；TGIF2还负调控NFI（Nfia/Nfib/Nfix）家族促分化因子。TGIF2在神经系统发育中不同于其在肿瘤中拮抗TGFβ-SMAD的功能，而是直接招募共抑制复合物调控神经发生启动态与NSC维持。TGIF2活性受MAPK/ERK信号磷酸化发育性调控。综上，TGIF2是协调神经发生启动态与NSC维持的关键转录抑制因子。